疏血通脈膠囊對腦缺血-再灌注大鼠p38MAPK的影響*

劉泰，黃德慶，張元侃，李丹，黃樹武，譚璐璐，劉永輝，李生，姚平，宋曦，何乾超

(廣西中醫藥大學第一附屬醫院腦病科，南寧 530023)

疏血通脈膠囊對腦缺血-再灌注大鼠p38MAPK的影響*

劉泰，黃德慶，張元侃，李丹，黃樹武，譚璐璐，劉永輝，李生，姚平，宋曦，何乾超

(廣西中醫藥大學第一附屬醫院腦病科，南寧 530023)

目的 研究疏血通脈膠囊預處理對大腦中動脈閉塞再灌注大鼠腦保護作用及對腦內p38絲裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)表達的影響。方法 將96只雄性SD大鼠隨機分為4組，每組24只，每組按照再灌注后3，6，24，72 h隨機分為4個亞組，每個亞組6只。假手術組只分離動脈不插線。缺血-再灌注組建成大腦中動脈閉塞再灌注(MCAO)模型。預缺血組腦缺血預處理，24 h后建立MCAO模型；疏血通脈組先給予疏血通脈膠囊14 d，再制備MCAO模型。Zea Longa 法進行神經功能缺損評分，免疫印跡法檢測p38MAPK、P-p38MAPK表達，Tunel法檢測神經元凋亡數量，觀察p38MAPK、P-p38MAPK表達水平與神經元凋亡相關性。結果 假手術組各時間點均未出現神經功能缺損，其余各組大鼠各時間點均出現不同程度神經功能缺損，并均于24 h達高峰。與缺血-再灌注組比較，預缺血組和疏血通脈組各時間點神經功能缺損情況較輕(P<0.05)。預缺血組與疏血通脈組各時間點神經功能缺損情況相當。假手術組不同時間點P-p38MAPK/p38MAPK比值未見明顯變化；其他3組P-p38MAPK/p38MAPK比值增大，且隨再灌注時間延長，該比值逐漸升高，24 h達到高峰。預缺血組和疏血通脈組從3 h起，P-p38MAPK/p38MAPK比值減小，并隨再灌注時間延長逐漸下降，24 h最低，與缺血-再灌注組比較，均差異有統計學意義(P<0.05)。預缺血組與疏血通脈組不同時間點磷酸化水平相當。假手術組各時間點偶見極少量凋亡神經元，其他各組隨再灌注時間延長，神經元凋亡數量逐漸增加, 并于24 h達到高峰。預缺血組和疏血通脈組不同時間點神經元凋亡數量均較缺血-再灌注組少(P<0.05)。結論 疏血通脈膠囊預處理可誘導大鼠腦缺血耐受，減少腦缺血-再灌注后神經元凋亡，改善神經功能，其機制可能與抑制p38MAPK磷酸化有關。

疏血通脈膠囊；預處理，腦缺血；缺血-再灌注，腦；p38絲裂原激活蛋白激酶

在機體接受致死性缺血刺激前給予多種非致死性刺激，可以使機體產生對缺血的保護作用。其中，提前進行的非致死性刺激稱為預處理，預處理后產生的對缺血的保護作用稱為缺血預適應[1]。以預處理為手段，研究腦缺血預適應產生的機制，可為臨床缺血性腦血管疾病提供新的防治策略。缺血預處理對機體是一種創傷，難以在臨床中應用。藥物預處理由于其可操作性強，成為近年來神經系統藥理性預適應研究的熱點。預處理可激活多種內源性信號，誘導缺血耐受[2]，從而提高組織對后續較嚴重缺血的適應能力，降低損傷程度。P38絲裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)作為眾多信號轉導通路的中轉站，近來研究發現其參與了腦缺血耐受的發生發展過程，但所起作用仍受爭議。疏血通脈膠囊的組方是廣西中醫藥大學第一附屬醫院的經驗方，前期研究發現其可改善腦血流，減輕神經元損傷，促進神經功能恢復， 在治療缺血性卒中方面有一定療效[3-5]。這些腦保護作用能否通過預處理手段誘導產生腦缺血耐受或提高腦缺血預適應能力尚未可知。筆者在本實驗中以p38MAPK為切入點，探討疏血通脈膠囊預處理所誘導的內源性神經元保護機制及作用靶點，以期為研發防治缺血性腦血管病藥物提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康成年雄性斯潑累格·多雷(Sprague-Dawley,SD)大鼠96只，購自廣西醫科大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK桂2009-0002，合格證號：0006909，體質量220～250 g，飼養于廣西中醫藥大學第一附屬醫院實驗室。動物實驗室溫度：22～25 ℃，相對濕度：55%～70%。大鼠給予普通飼料，自由進食飲水，黑暗與光照時間比為12 h：12 h。

1.2 抗體和試劑 p38MAPK抗體，批號：AF4656；磷酸化p38MAPK抗體(P-p38MAPK磷酸化位點：pTyr180/Thr182)，批號：AF4001。均購自美國Affinity公司；蛋白酶K購自美國Sigma公司。批號：P6556；Tunel凋亡試劑盒(In Situ Cell Death Detection Kit，POD)購自德國Roche公司，批號：11684 817910；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜購自Millipore公司，批號：11981123；辣根過氧化物酶標記山羊抗大鼠，批號：A0208；聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒，批號：P0010S；聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒，批號：P0012A。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與模型的建立 將大鼠編號，按照計算機產生的隨機序列分為4組，每組24只：①假手術組，只分離動脈不插線；②缺血-再灌注組，參照改良Longa法[6]建立大腦中動脈閉塞再灌注(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型；③預缺血組，預缺血3 min、再灌注24 h后采用相同方法造成MCAO；④疏血通脈組，具體方法同缺血-再灌注組。各組單籠喂養，自由進食、飲水，術中死亡大鼠及時補充。造模前，疏血通脈組參照《現代醫學實驗動物學》[7]，以純化水為溶媒，將疏血通脈膠囊內容物制成等體積混懸液，按每次380 mg·kg-1灌胃，其余3組灌胃給予等量純化水，灌胃時間均為14 d。

1.3.2 取材及組織處理 各組大鼠手術清醒后，按Zea Longa 5分制標準[6]進行評分。0分：正常，無神經損傷癥狀；1分：不能完全伸展對側前爪；2分：向外側轉圈；3分：向對側傾倒；4分：不能自發行走，意識喪失。然后每組按再灌注后3，6，24，72 h不同時間點分成4個亞組，每亞組6只大鼠，斷頭處死，剝離大腦梗死區皮質，一部分迅速放入-80 ℃冰箱保存，測定p38MAPK、P-p38MAPK蛋白表達水平。另一部分置于4%甲醛溶液固定保存，制作石蠟切片，Tunel法檢測神經元凋亡情況。

1.3.3 免疫印跡法檢測p38MAPK、P-p38MAPK表達水平 取大鼠梗死區皮質組織，研磨棒下進行組織研磨，同時加入適量蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，低溫高速離心后吸取上清液，即得胞質蛋白成分。BCA法蛋白定量[8]，-20 ℃冰箱保存備用。取蛋白樣品，加入上樣緩沖液，100 ℃加熱變性5 min，以7 720 r·min-1(r=3 cm)離心30 s。分別取各組蛋白樣品20 μL進行SDS-PAGE電泳和轉膜(使用PVDF膜，100 V電壓進行50 min)。取出PVDF膜，三乙醇胺緩沖鹽水溶液(tris buffered saline，TBS)洗滌5 min，加入封閉液常溫封閉1 h，封閉后加一抗4 ℃孵育過夜，次日TBST(TBS加入聚山梨酯)洗膜3次，加二抗，37 ℃孵育1 h。TBST洗滌3次共10 min，發光反應1 min，壓片、顯影、定影，掃描條帶并分析結果。檢測內參時同樣按上述方法進行。以P-p38MAPK與p38MAPK的比值(P-p38MAPK/p38MAPK)表示p38MAPK磷酸化水平。

1.3.4 Tunel法檢測神經元凋亡 將石蠟切片先后置二甲苯及無水乙醇中室溫浸泡，各2次，每次5 min；進行梯度洗脫及磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)室溫浸洗。4%多聚甲醛室溫固定15 min。PBS室溫浸洗5 min，共2次。甩去多余液體，抗原微波熱修復：將組織切片放入0.01 mol·L-1枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)，在微波爐里加熱5 min至沸騰，斷電，室溫冷卻后PBS洗3次，每次3 min。加Tunel反應混合液。蓋上覆膜，37 ℃1 h。移去覆膜，PBS室溫浸洗5 min，共3次。加Converter-POD反應液，蓋上覆膜，37 ℃30 min。移去覆膜，PBS室溫浸洗5 min，共3次。加二氨基苯聯胺(diaminobenzidine，DBA)顯色液100 μL室溫反應約10 min。用去離子水沖洗后脫水，透明封片，400倍光鏡鏡檢。

1.4 統計學方法 使用SPSS 17.0版軟件進行統計分析，多組間均數比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齊則行LSD(L)檢驗，方差不齊則取Tamhane’s T2檢驗結果。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 神經功能缺損評分 假手術組大鼠各時間點活動均正常，評分均為0分。缺血-再灌注組各時間點神經功能評分明顯高于預缺血組和疏血通脈組，且24 h為高峰(表1)，差異有統計學意義(P<0.01)。預缺血組與疏血通脈組各時間點神經功能評分差異無統計學意義。

2.2 免疫印跡法檢測P-p38MAPK/p38MAPK結果 各組各時間點P-p38MAPK/p38MAPK表達水平見圖1。one-way ANOVA檢驗提示，各組均數不全相同(3，6，24，72 h時間點的組間F值分別為232.96，681.02，1550.32，961.85)。缺血-再灌注組從3 h時即出現p38MAPK信號通路明顯激活(表現為P- p38MAPK表達水平上調，P-p38MAPK/p38MAPK比值增大)，并逐漸升高，于24 h達到高峰(圖1)；而預缺血組和疏血通脈組從3 h即出現p38MAPK信號通路明顯受抑制現象(表現為P-p38MAPK表達水平下調，P-p38MAPK/p38MAPK比值減小)，并逐漸下降，于24 h達最低點。各時間點與假手術組比較，均差異有統計學意義(P<0.05)。預缺血組、疏血通脈組各時間點磷酸化水平均低于缺血-再灌注組，均差異有統計學意義(P<0.05)。各時間點預缺血組與疏血通脈組比較差異無統計學意義。

2.3 神經元凋亡情況 各時間點隨機視野觀察中，假手術組偶見極少量凋亡細胞。缺血-再灌注組、預缺血組及疏血通脈組隨著腦缺血-再灌注時間延長，細胞凋亡數量逐漸增加，并于24 h達高峰(圖2)。預缺血組與疏血通脈組各時間點細胞凋亡數量均較缺血-再灌注組少，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

3 討論

缺血性腦血管病屬于中醫學中風病范疇。研究提示，中藥復方制劑對本病有較好療效[8-9]。劉泰教授根據中風“本虛標實，痰瘀互結”的辨證特點，總結自己20多年來治療中風病的經驗，立足中風“痰瘀致病”理論[8]，擬三七、膽南星、地龍、石菖蒲、冰片等藥物自創醒腦通脈方，前期研究均提示該方有較好的腦保護作用[3-5]。隨著研究的深入，劉泰教授保留了化痰祛瘀的理念，在原方基礎上去掉膽南星、石菖蒲兩味具有微毒的中藥，換之以通陽散結、行氣導滯的薤白和清熱化痰、利氣散結的瓜蔞皮，進一步優化成疏血通脈膠囊處方，不但加強了治療效果，而且保證了用藥安全。方中三七、薤白為君藥，化痰祛瘀通絡；地龍、瓜蔞皮為臣藥，協同君藥，加強活血祛痰作用；冰片為佐使藥，開竅醒神、清熱止痛。全方共奏化痰熄風，祛瘀通絡，痰瘀同治，疏血通脈之功。本方所用藥物經現代藥理研究證實，均具有良好的改善腦循環、抗神經細胞凋亡、保護血管內皮細胞及減輕炎癥反應等作用[9-12]。本研究結果提示，在大鼠腦缺血前預先給予疏血通脈膠囊灌胃，能夠明顯減少大鼠腦缺血-再灌注損傷后神經元凋亡的數量，減輕神經功能缺損癥狀。細胞死亡的形式包括壞死、凋亡、自噬等，其中凋亡是細胞對環境的生理性病理性刺激信號、環境條件的變化或緩和性損傷產生的應答有序變化的死亡過程，是細胞死亡的主要形式之一。本研究中細胞凋亡的數量與神經功能損傷程度呈正相關，提示減少神經元凋亡數量可以起到腦保護作用。同時，免疫印跡檢測結果提示，疏血通脈膠囊預處理能夠顯著下調P-p38MAPK的表達水平，提示疏血通脈膠囊預處理可能通過抑制p38MAPK的磷酸化誘導腦缺血耐受的發生，起到了腦保護作用。此外，筆者還觀察到各時間點疏血通脈組神經功能缺失、神經元凋亡均輕于預缺血組，且P-p38MAPK活化程度均低于預缺血組，提示疏血通脈膠囊的腦保護作用可能還與其他環節有關。

表1 4組大鼠腦缺血-再灌注后不同時間亞組神經功能缺損評分和神經無調亡情況比較

Tab.1 Comparison of neurologic impairment score and neuronal apoptosis among different time point subgroups of four groups of rats

n=6

與缺血-再灌注組同時間亞組比較，均P<0.01

Compared with the same time subgroup of ischemia/reperfusion group，averageP<0.01

A.假手術組；B.缺血-再灌注組；C.預缺血組；D.疏血通脈組；β-Tubulin為內參

A.sham operation group；B.ischemia/reperfusion group；C.ischemia preconditioning group；D.Shuxuetongmaigroup；β-Tubolin as internal reference

Fig.1 P-p38MAPK/p38MAPK in infarction area in four groups of rats at each time point after reperfusion(n=6)

A.假手術組；B.缺血-再灌注組；C.預缺血組；D.疏血通脈組

A.sham operated group；B.inchemia/reperfusion group；C.ischemia preconditioning group；D.Shuxuetongmaigroup

Fig.2 Neuronal apoptosis in four groups of rats at 24 h(×400)

p38MAPK是家族成員， 主要分布在細胞質區，一旦被激活迅速轉位入核，參與調控細胞生長、分化和凋亡等多種功能。目前， 已有大量文獻報道p38MAPK在腦缺血耐受中發揮重要作用，但結果并不一致。LI等[13]研究發現P-p38MAPK通過Bcl-xL途徑減少神經細胞凋亡。而YAMASHITA等[14]的研究則表明抑制p38MAPK的活化起到腦保護作用。本研究發現，腦缺血預處理可明顯減少大鼠腦缺血-再灌注后梗死區皮質神經元凋亡數量，改善神經功能，有明確的腦保護效應；預缺血組大鼠p38MAPK信號通路被抑制，表現為P-p38MAPK/p38MAPK比值顯著下降，并于24 h時降到最低水平，這與文獻報道一致。本研究結果提示，p38MAPK信號通路的激活可導致神經細胞凋亡，腦缺血耐受的產生與抑制p38MAPK的活化有關。

總之，疏血通脈膠囊預處理通過抑制p38MAPK的磷酸化，起到誘導腦缺血耐受、發揮腦保護作用。這為藥物預處理誘導腦缺血耐受產生或提高腦缺血預適應能力提供了實驗基礎，為缺血性腦血管病的臨床有效防治提供了科學依據。疏血通脈膠囊預處理是否存在量效關系、腦損傷前何時給藥或腦缺血后繼續給藥能否進一步提高其防治腦卒中的作用仍待進一步研究。

[1] SUN X C，XIAN X H，LI W B，et al.Activation of p38-MAPK participates in brain ischemic tolerance induced by limb ischemic preconditioning by up-reguting HSP 70[J].Exp Neurol，2010，224(2)：347-355.

[2] MARIA K，LIBUSA K，MARTINA P，et al.Intracellular signaling MAPK pathway after cerebral ischemia-reperfusion injury[J].Neurochem Res, 2012，37(7)：1568-1577.

[3] 劉泰，韋必清，韋玉進.醒腦通脈膠囊對腦缺血-再灌注損傷神經細胞凋亡的影響[J].遼寧中醫雜志，2005，32(2)：89.

[4] 劉泰， 張青萍， 吳林.醒腦通脈膠囊對腦缺血-再灌注損傷大鼠腦組織谷氨酸、天門冬氨酸的影響[J].廣西中醫藥，2008，31(1)：53-56.

[5] 劉泰，秦若飛，張青萍，等.醒腦通脈膠囊對大鼠局灶性腦缺血-再灌注后腦后織 IL-1β、IL-6和IL-8含量的影響[J].廣西醫科大學學報，2008，25(1)：1-4.

[6] SMITH M L，BENDEK G，DAHLGREN N，et al.Models for studying long-term recovery following forebrain ischemia in gteh rat：2.A 2- vessel occlusion mode[J].Acta Neurol Scand，1984，69(5)：385.

[7] 施新獻.現代醫學實驗動物學[M].北京：人民軍醫出版社，2000：334.

[8] CHEN L，YU Z，LEE Y，et al.Quantitative evaluation of proteins with bicinchoninic acid(BCA)：resonance Raman and surface enhanced resonance Raman scattering-based methods[J].Analyst，2012，137(24)：5834-5838.

[9] 胡仁林，張細六，李鳴，等.丹紅注射液聯合依達拉奉治療腦梗死50例[J].醫藥導報，2014，33(8)：1050-1053.

[10] 邵夢茹，文思，劉靜，等.復方血栓通膠囊改善小鼠腦缺血與耐缺氧作用[J].醫藥導報，2014，33(7)：866-868.

[11] 梁妮，劉泰.醒腦通脈膠囊的中醫理論探源[J].時珍國醫國藥，2008，19(7)：1706.

[12] 劉泰，張志偉.疏血通脈膠囊中醫理論探源[J].時珍國醫國藥，2012，23(9)：2295-2297.

[13] LI Z， XU L， JING L，et al.Phosphorylation of p38MAPK mediates hypoxic preconditioning-induced neuroprotection against cerebral ischemic injury via mitochondria translocation of Bcl-xL in mice[J].Brain Res，2013，15(3)：78-88.

[14] YAMASHITA S，HIRATA T，MIZUKAMI Y，et al.Repeated preconditioning with hyperbaric oxygen induces neuroprotection against forebrain ischaemia via suppression of p38 mitogen activated protein kinase[J].Brain Res, 2009, 13(1)：171-179.

[15] WANG Y X，XU X Y，SU W L，et al.Activation and clinical significance of p38MAPK signaling pathway in patients with severe trauma[J].J Surg Res，2010，161(1)：119-125.

DOI 10.3870/yydb.2015.07.002

Effects ofShuxuetongmaiCapsule on Expression of p38MAPK in Rats with CerebralIschemia/Reperfusion

LIU Tai，HUANG Deqing，ZHANG Yuankan，LI Dan，HUANG Shuwu，TAN Lulu，LIU Yonghui， LI Sheng，YAO Ping，SONG Xi，HE Qianchao

(DepartmentofEncephalopathy,theFirstAffiliatedHospital,GuangxiUniversityofTCM，Nanning530023,China)

Objective To explore the neuroprotection ofShuxuetongmaicapsule pretreatment，and the effect on the expression of p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK) in rats with middle cerebral artery occlusion. Methods Ninety-six male SD rats were divided randomly into sham-operated group，ischemia/reperfusion group (I/R)，ischemia preconditioning group (IP)，andShuxuetongmaigroup(n=24).Each group was further randomly divided into 4 subgroups by 3 h, 6 h, 24 h and 72 h after reperfusion, 6 rats in each subgroup.Sham-operated group was only performed artery separation .The middle cerebral artery occlusion(MCAO) model was set up in I/R rats by Longa method.The IP rats were performed for three minutes on the bilateral carotid artery ligation, and formed MCAO model 24 hours later.The rats in theShuxuetongmaigroup were pretreated withShuxuetongmaicapsules for 14 days on gavage before the establishment of MCAO model.The neurological deficits were graded in rats by Zea Longa method.Western Blot was used to determine the protein expression of p38MAPK and P-p38MAPK.Tunel method was applied to detect the apoptosis of neurons and the relationship between expression of p38MAPK, P-p38MAPK and apoptosis of neuron. Results No neurological dysfunction appeared in the sham-operated group at each time points, but not for the other groups, which reached the peak at 24 h.Compared with the I/R group, IP group andShuxuetongmaigroup presented the mild neurologic function deficiency at different time points in rats (P<0.05), and no significant differences occurred between ischemia preconditioning group andShuxuetongmaigroup (P>0.05).The obvious variation of the value of P-p38MAPK/p38MAPK wasn't detected in sham-operated group at different time points, while obviously presented in I/R group, and the ratios of P-p38MAPK/p38MAPK were increased gradually followed with reperfusion, approaching to the highest level at 24 h.Compared with the I/R group, the P-p38MAPK/p38MAPK declined from 3 h and to the lowest level at 24 h of reperfusion, in both IP andShuxuetongmaigroups(P<0.05), and with similar phosphorylation.At different time points，very few neurons apoptosis were detected in sham-operated groups, but which increased gradually after reperfusion in other groups, and reached to the peak at 24 h.The neurons apoptosis in both IP group andShuxuetongmaigroup were less than that in IR group (P<0.05) at different time points, and it showed no significant differences on neurons apoptosis between ischemia/preconditioning group andShuxuetongmaigroup in rats (P>0.05). ConclusionShuxuetongmaicapsule pretreatment can induce brain ischemic tolerance，attenuate the apoptosis of neurons in cerebral ischemia reperfusion，and improve neurologic function.The mechanism may be related to the inhibition of p38MAPK phosphorylation.

Shuxuetongmaicapsule；Preconditioning, cerebral ischemic; Ischemia/reperfusion, cerebral；p38 mitogen-activated protein kinase

2014-07-12

2014-08-20

*廣西自然科學基金資助項目(2011GXNSFA018180)；廣西科學研究與技術開發計劃項目(桂科攻11107009-1-11)

劉泰(1959-)，男，廣西桂林人，主任醫師，教授，學士，研究方向：腦血管疾病的中西醫結合臨床、科研和教學。電話：0771-5848502，E-mail：liutai590216@163.com。

何乾超(1976-)，男，副主任醫師，碩士，研究方向：腦血管疾病的中西醫結合臨床、科研和教學工作。電話：0771-5848502，E-mail：liutai590216@163.com。

R286；R965

A

1004-0781(2015)07-0851-05