腦創傷后Edaravone腦保護作用機制的實驗研究

尹立國 崔建忠 高俊玲 趙雅寧

腦創傷后Edaravone腦保護作用機制的實驗研究

尹立國 崔建忠 高俊玲 趙雅寧

目的:探討Edaravone對腦創傷后保護作用的可能機制。方法采用改進的Marmarou’s法建立大鼠中度閉合性彌漫性顱腦損傷模型，應用TAB法、免疫組化，TUNEL法對大鼠傷后皮質自由基、細胞色素C及凋亡細胞數進行動態觀察。結果傷后給予Edaravone能明顯減少自由基水平，降低細胞色素c表達和神經元細胞凋亡數。結論Edaravone對顱腦創傷有治療作用，其機制之一是通過減少自由基生成，抑制線粒體膜通透性轉換孔(MPTP)開放，減少細胞色素c釋放，進而減少神經細凋亡。

腦創傷;Edaravone;自由基;線粒體膜通透性轉換孔;細胞色素c;凋亡

創傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)有較高的發生率，是導致創傷患者傷殘及死亡的主要原因，嚴重危害人類健康，給社會和家庭帶來沉重負擔。Edaravone(3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one)是一種強力的自由基清除劑，能阻礙脂氧合酶代謝［1］并且在臨床治療急性腦缺血，取得良好效果［2，3］。但對其腦保護作用具體機制的研究筆者尚不多見，本研究運用改進的Marmarou方法建立大鼠彌漫性腦損傷型，證明腦創傷后Edaravone對腦保護作用的可能機制，以期為臨床治療提供理論依據和開拓新的治療前景。

1 材料與方法

1.1 腦創傷模型的制備與分組健康雄性SD大鼠90只(體重300～350 g，購自北京維通力華公司，清潔級，自然光照，環境安靜，溫度適中，大鼠自由進食水，飼養1周后進行實驗)隨機分為對照組、顱腦創傷組、治療組。每組設傷后1 h、3 h、6 h、24 h、48 h、72 h 6個時相點。對照組每個時相點3只大鼠，創傷組和治療組每個時相點6只大鼠。各組未達到規定時相點死亡的大鼠從實驗中剔除。另取90只大鼠按相同的方法分組，用于丙二醛(MDA)測定。動物置乙醚麻醉缸中，以乙醚吸入方式深度麻醉動物，麻醉后的大鼠俯臥于落體致傷海綿墊上，70%乙醇消毒顱頂部皮膚，沿正中線矢狀切開頭皮，剝離骨膜，顯露人字縫與冠狀縫，將一不銹鋼墊固定在大鼠冠狀縫與人字縫之間將大鼠頭部固定于打擊模型架下的頭部固定裝置中，使重450 g，直徑18 mm的銅柱沿垂直玻璃管于1.2 m高度自由落下，撞擊大鼠顱骨頂部的鋼墊，造成大鼠中度彌漫性顱腦損傷。撞擊后即刻移開大鼠，以免銅柱反彈造成頭部二次打擊傷。給予顱腦損傷后大鼠，頭皮切口常規消毒、縫合。對照組僅給予相同的麻醉處理及沿中線矢狀切開頭皮、剝離骨膜、在冠狀縫與人字縫之間粘鋼墊，置致傷海綿墊上，但不行自由落體致傷，而后常規消毒、縫合切口。3組未到規定時相死亡的大鼠予以剔除。

1.2 給藥方法治療組Edaravone 10 mg/kg，對照組、創傷組給予等量0.9%氯化鈉溶液。注射方法為傷后10 min，尾靜脈注射，每24小時注射1次。

1.3 標本檢測

1.3.1 氧自由基中間產物MDA測定大鼠按傷后各時相點麻醉，迅速斷頭處死，取大腦皮質受損及周圍區0.5 cm，在0℃用剪刀將組織剪碎成泥，冰上勻漿后按南京建成MDA檢測說明書提供方法進行檢測。

1.3.2 細胞色素c檢測:標本甲醛固定，石蠟切片，按武漢博士德提供細胞色素c檢測試劑盒說明書方法進行檢測。

1.3.3 原位細胞凋亡檢測(TUNEL法)按Roche公司提供TUNEL檢測試劑盒進行操作。

1.3.4 陽性細胞免疫反應強弱:采用Motic Med 6.0計算機真彩色圖象分析系統以平均光密度進行半定量分析。

1.4 統計學分析應用SPSS 11.5統計軟件，計量資料以±s表示，多組間同一時間點及同一組中不同時間點比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 氧自由基檢測結果傷后6 h即可檢測到MDA升高，隨著時間推移逐漸增高，與對照組相比較，24 h已顯著升高(P＜0.01)，48 h達高峰。與創傷組比較，藥物處理組在各時相點均明顯降低，以24、48和72 h差異有統計學意義(P＜0.01)。見表1。

表1 大鼠腦創傷后大腦皮質自由基(MDA)水平動態變化nmol/mgpro，±s

表1 大鼠腦創傷后大腦皮質自由基(MDA)水平動態變化nmol/mgpro，±s

注:與對照組比較，*P＜0.01;與創傷組比較，#P＜0.01

組別傷后1 h傷后3 h傷后6 h傷后24 h傷后48 h傷后72 h對照組(n=18)4.55±0.12 4.50±0.12 4.56±0.11 4.52±0.17 4.50±0.11 4.38±0.19創傷組(n=36)4.56±0.11 4.57±0.15 4.74±0.14 5.74±0.15*7.66±0.16*6.37±0.11*治療組(n=36)4.54±0.11 4.57±0.12 4.71±0.10 5.32±0.09*#6.24±0.05*#5.43±0.15*#

2.2 創傷組Ctyc免疫反應在傷后6 h即升高，傷后24 h達高峰，以后迅速下降，Edaravone治療組與創傷組比較明顯降低，在24 h、48 h、72 h差異有統計學意義(P＜0.01)。見表2、圖1～3。

表2 大腦創傷后大腦皮質cyt-c表達動態變化平均光密度值×10 000，±s

表2 大腦創傷后大腦皮質cyt-c表達動態變化平均光密度值×10 000，±s

注:與對照組比較，*P＜0.01;與創傷組比較，#P＜0.01

組別傷后1 h傷后3 h傷后6 h傷后24 h傷后48 h傷后72 h對照組(n=18)4.84±0.15 4.83±0.08 4.87±0.11 4.85±0.17 4.96±0.10 4.96±0.14創傷組(n=36)4.88±0.12 5.85±0.18*6.99±0.19*15.53±0.16*8.74±0.10*6.69±0.12*治療組(n=36)4.81±0.09 5.88±0.13*6.80±0.18*13.54±.10*#6.76±0.13*#5.82±0.10*#

2.3 傷后1 h即可見少量凋亡細胞，以后凋亡細胞數逐漸增多，并于48 h達高峰，Edaravone明顯降低腦創傷后大鼠大腦皮質神經細胞凋亡數，與創傷組比較在24 h、48 h、72 h差異有統計學意義(P＜0.01)。見表3，圖4～6。

表3 大鼠腦創傷后大腦皮質神經凋亡數的動態變化±s

表3 大鼠腦創傷后大腦皮質神經凋亡數的動態變化±s

注:與對照組比較，*P＜0.01;與創傷組比較，#P＜0.01

組別傷后1 h傷后3 h傷后6 h傷后24 h傷后48 h傷后72 h對照組3.5±0.8 3.4±1.3 3.7±1.3 3.8±0.7 4.7±0.9 4.14±0.14創傷組40.4±4.6*54.2±3.2*64.2±2.5*90.8±1.9*106.0±5.2*93.56±3.06*治療組38.5±2.4*53.9±2.6*63.0±2.2*#82.5±2.1*#94.1±2.1*#80.87±2.15*#

圖1 對照組大鼠大腦皮質cyt-c表達(免疫組化×400)

圖2 創傷24 h大鼠大腦皮質cyt-c表達(免疫組化× 400)

圖3 給藥24 h大鼠大腦皮質cyt-c表達(免疫組化× 400)

圖5 創傷后48 h大鼠大腦皮質(TUNEL染色×400)

圖4 對照組大鼠大腦皮質(TUNEL染色×400)

圖6 給藥48 h大鼠大腦皮質(TUNEL染色×400)

3 討論

生理狀態下，機體自由基的產生與清除間保持著動態平衡。腦創傷后，線粒體在導致組織組織損傷的分子事件中起到關鍵性作用，由于顱內壓增高，血管痙攣及呼吸紊亂等，產生能量代謝障礙，由線粒體呼吸鏈和胞漿酶系(如黃嘌呤氧化酶)產生大量自由基，導致氧化應激。Crompton［4］論述了ROS的形成增多導致PTP開放。線粒體膜通透性轉換孔(PTP)開放后可導致細胞壞死和凋亡［4－6］。Lewen等［7］也認為TBI后氧自由基產生增加可以導致線粒體功能紊亂，增加的氧自由基與鈣離子相互作用導致線粒體膜滲透性轉換孔開放，細胞色素c從損壞的線粒體釋放，通過caspase依賴方式，誘導細胞凋亡。

Edaravone(3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one)是2001年開發上市的神經元保護劑和具有捕獲羥自由基的活性抗氧化劑。顧學蘭等［8］研究結果表明Edaravone注射液能有效減輕腦出血后神經功能缺損癥狀和出血后繼發性缺血性損傷。在大鼠局灶腦缺血模型中，Edaravone能明顯減輕腦缺血，減少腦梗死面積。作用機制可能是抑制主要包括自由基和脂質過氧化物在內的脂氧化酶［9］。該藥主要用于治療急性腦梗死，但關于腦創傷的研究鮮有報道，本研究應用Marmarou腦創傷模型，研究Edaravone對腦創傷的保護作用。本試驗中，Edaravone能顯著降低各時段代表自由基含量的MDA水平，還降低了由線粒體釋放的Cytc的表達并減少腦創傷后的神經細胞凋亡數量，說明腦創傷后Edaravone有明顯的腦保護作用，其機制之一是通過減少自由基生成，通過線粒體釋放Cytc的某個環節而發揮其腦保護作用。一項關于心肌缺血再灌注的實驗證明Edaravone能作用于MPTP，有效地減少缺血再灌注損傷引起的心肌梗死面積和心肌細胞凋亡以及線粒體的腫脹程度［10］。既然自由基能作用于線粒體膜滲透性轉換孔，使其開放引起細胞釋放細胞色素c，引起細胞凋亡，而Edaravone是一種強力的自由基清除劑，減少代表PTP功能狀態的Cytc的表達進而減少細胞凋亡。結合本實驗數據，可以肯定腦創傷后Edaravone對腦保護的作用機制之一是通過限制線粒體滲透性轉換孔開放減少細胞色素c釋放而起作用的。

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Experimental study of the protective effect of Edaravone on brain after traumatic brain injury

YIN Liguo*，CUI Jianzhong，GAO Junling，et al.*Department of Neurosurgery，Zunhua City People’s Hospital，Hebei，Zunhua 064200，China

ObjectiveTo investigate the possible action mechanism of protective effect of Edaravone on brain after traumatic brain injury.M ethodsThe middle degree closed diffused craniocerebral injury models in rats were established by improved Marmarou＇s method.After the models were successfully established，the free radical in cortex of the rats，Cyt-c and apoptosis cell numbers were detected and observed dynamically by TAB，immunohistochemry，TUNEL，respectively.ResultsEdaravone could decrease obviously the levels of free radical，the expression of Cyt-c and apoptosis nerve cells after traumatic brain injury Conclusion Edaravone is effective in treating traumatic brain injury，and one of action mechanisms is to reduce generation of free radical，inhibit opening of mitochondrial permeability transition pore(MPTP)，reduce releasing of Cytc，and then decrease nerve cell apoptosis.

traumatic brain injury;Edaravone;free radical;mitochondrial permeability transition pore;Cytc;apoptosis

R 749.12

A

1002－7386(2015)03－0353－03

2014－09－21)

10.3969/j.issn.1002－7386.2015.03.008

064200河北省遵化市人民醫院(尹立國);河北省唐山市工人醫院(崔建忠);河北聯合大學(高俊玲、趙雅寧)

崔建忠，063000河北省唐山市工人醫院; E-mail:JZHC01@hotmail.com