木犀草素對脂多糖誘導下小鼠急性肺損傷的保護作用及其機制研究

戴麗端 莉梅 姚志清

木犀草素對脂多糖誘導下小鼠急性肺損傷的保護作用及其機制研究

戴麗端 莉梅 姚志清

目的:探討木犀草素(luteolin)對脂多糖(1ipopolysaccharid，LPS)誘導的小鼠急性肺損傷的保護作用，以及可能的作用機制。方法96只小鼠隨機分為正常組、模型組、木犀草素低劑量組、木犀草素中劑量組、木犀草素高劑量組及地塞米松組，每組8只。以小鼠氣道穿刺滴入LPS制備小鼠ALI模型，呼吸機檢測氣道吸氣阻力(Ri)、氣道呼氣阻力(Re)和動態肺順應性(Cdyn)的變化，ELISA法測定肺泡灌洗液(BALF)中IL-1β、IL-6和TNF-α的濃度，制作HE病理切片以及Western blot法檢測肺組織中NF-κB p65、IκB-α和PIκB-α的表達情況。結果木犀草素能明顯抑制Ri、Re增長和Cdyn降低，抑制BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α的釋放(P＜0.05)，減輕了肺部病變，抑制了NF-κB p65和PIκB-α的活化。結論木犀草素對LPS誘導的小鼠急性肺損傷具有保護作用，其作用機制與抑制NF-κB信號傳導通路表達有關。

木犀草素;急性肺損傷;脂多糖;肺功能

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是由多種原因引起的以肺泡毛細血管膜通透性增高為特征的肺損傷，是臨床重癥監護患者主要的死亡原因，病死率達到30%～50%［1－3］。ALI病因復雜，多種疾病可并發ALI，致病環節眾多，其中過度失控的炎性反應和促炎、抗炎反應失衡是該疾病的主要發病機制，炎性細胞因子和趨化因子間的復雜網絡調控在啟動、放大和促進病理進程中起到重大作用［4］，迄今仍無有效治療ALI的方法和藥物。木犀草屬屬于黃酮類化合物，因最初從木犀草科木犀草屬草本植物木犀草的葉、莖、枝中分離出而得名，是一種天然色素組分，具有很高的生物活性，如抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調劑、抑菌等作

用［5］。木犀草素的抗炎作用與抑制炎性介質的釋放與核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)介導的基因表達有關。本文旨在探討木犀草素對ALI是否有干預和保護作用及其在體內的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物健康雄性ICR小鼠，體重18～22 g，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，許可證號碼: SCXK(滬)2008-0016。飼養于室溫、充分給水和食物。

1.2 試劑及藥物脂多糖(LPS)(大腸桿菌O111: B4，Sigma公司，076K4020);木犀草素(Sigma公司);地塞米松磷酸鈉注射液(金陵藥業股份有限公司，080201);戊巴比妥鈉(國藥集團化學試劑有限公司，WS 20060401);小鼠白介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒(A6071384)、IL-6 ELISA試劑盒(A6071377)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(A6071379)均購自R＆D公司;Braford蛋白含量檢測試劑盒、NF-κB p65 Antibody、IκB-α Antibody、IκB-α(Phospho-ser32)Antibody、內參一抗(β-Actin)、內參一抗(Lamin B)、辣根過氧化酶標記的二抗均購于南京凱基生物科技發展有限公司;其他試劑均為國產分析純。

1.3 主要儀器動物肺功能分析系統(AniRes2005型，北京貝蘭博科技有限公司);酶標儀(680型，美國BIO-RAD公司);低溫離心機(SH03014型，美國科俊儀器公司);超低溫冰箱(1500型，日本SANYO公司)，Western電泳儀(164-5051型，美國Bio-Rad公司)，分光光度計(UV-2540型，日本SHIMADZ公司)。

1.4 方法

1.4.1 實驗分組和模型的制備:96只小鼠隨機平均分為兩批，每批隨機平均分為6組，分別為正常組、模型組、木犀草素低劑量組、木犀草素中劑量組、木犀草素高劑量組及地塞米松組，每組8只。木犀草素低、中、高劑量組于造模前4 d分別灌胃給予25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg的木犀草素，正常組和模型組均灌胃給予相同體積的0.9%氯化鈉溶液。小鼠腹腔注射1%的戊巴比妥鈉(80 mg/kg)后暴露氣管，除正常組外，其余組氣管內緩慢注入5%的LPS溶液(5 mg/kg)，造成小鼠急性肺損傷，正常組以相同方式注入相同體積的0.9%氯化鈉溶液。

1.4.2 肺功能相關指標的檢測造模6 h后，取一批小鼠腹腔注射1%的戊巴比妥鈉(90 mg/kg)深度麻醉，氣管插管，將小鼠置于體描箱中。設置呼吸機的頻率為90次/min，潮氣量為5 ml/kg，呼吸比為15∶10。通過對動物氣道壓力(Press)、肺容積變化(Volume)的測量，計算出呼吸流速(Flow)、平均吸氣氣道阻力(Ri)、呼氣氣道阻力(Re)、肺動態順應性(Cdyn)，經AniRes 2005軟件進行分析，40 min后取出小鼠。

1.4.3 支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細胞因子的測定:取另一批小鼠，造模3 h后，結扎右肺，暴露氣管并插管，向左肺注入4℃0.9%氯化鈉溶液1 ml進行支氣管肺泡灌洗，重復3次。收集肺泡灌洗液并混勻，于4℃、1 500 r/min離心15 min。收集上清液，分裝后保存于－70℃超低溫冰箱中，ELISA試劑盒檢測檢測IL-1β、IL-6和TNF-α的濃度。

1.4.4 肺組織病理檢測:灌洗結束后，立刻取右肺上葉以10%甲醛溶液固定，HE染色，制作常規石蠟病理切片。觀察肺泡壁有無增厚、充血、炎性細胞浸潤，間質有無炎癥、水腫，肺泡有無壞死、出血等情況。

1.4.5 Western blot測定肺組織中p65、IκB-α、p IκB-α的表達:將100 mg右肺組織置于0.5 ml冰預冷裂解緩沖液中，用十字勻漿器勻漿，充分裂解。4℃，13 000 g，離心10 min，保留上清液。Braford法測定上清液中總蛋白濃度后，進行SDS-PAGE電泳。轉膜、封閉并加入相應的一抗(NF-κB p65抗體，1∶400;IκB-α抗體，1∶200;p IκB-α抗體，1∶200)4℃孵育過夜。PBST漂洗后，將膜與HRP結合的二抗(辣根過氧化酶標記抗體，1∶5 000)室溫下搖蕩孵育1 h。用PBST充分洗膜，然后將顯影液加于PVDF膜上，室溫放置1 min。暗室中迅速曝光、顯影、洗像。

1.5 統計學分析應用SPSS 11.5統計軟件，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 木犀草素對肺功能的影響造模6 h后，6組小鼠的Ri、Re隨時間的延長呈增長趨勢，其中模型組的增長百分比漲幅最大，正常組漲幅最小;6組小鼠的Cdyn隨時間的延長呈下降趨勢，其中模型組的下降百分比降幅最大，正常組降幅最小。木犀草素呈劑量依賴性的抑制Ri、Re的增長和Cdyn的下降。地塞米松也可明顯抑制Ri、Re的增長和Cdyn的下降。見圖1。

2.2 木犀草素對BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α的影響與正常組相比，模型組的IL-1β、IL-6和TNF-α均明顯增加(P＜0.01)。和模型組相比，地塞米松和木犀草素較明顯的降低了IL-1β、IL-6和TNF-α等細胞因子的含量(均P＜0.01)，其中，木犀草素200 mg/kg組作用效果更顯著。見表1。

表1 木犀草素對LPS誘導的ALI小鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α的影響n=10，pg/ml，±s

表1 木犀草素對LPS誘導的ALI小鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α的影響n=10，pg/ml，±s

注:與正常組比較，*P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.01

組別IL-1βIL-6 TNF-α正常組31±12 48±14 64±12模型組194±22*333±24*1 520±156*木犀草素50 mg/kg組123±12#221±31#842±39#木犀草素100 mg/kg組65±10#170±46#375±25#木犀草素200 mg/kg組43±12#83±7#108±8#地塞米松組55±10#72±13#106±13#

2.3 木犀草素對LPS誘導的小鼠ALI的保護作用在解剖過程中發現，模型組肺部水腫嚴重，肺表面粗糙有出血點，且氣管內有泡沫狀分泌物流出，正常組無這些癥狀。組織病理切片可見，被感染的肺出現重度炎癥，大量的中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等炎癥細胞浸潤肺部。肺組織結構發生改變，肺泡腔大面積消失，肺泡壁增厚。木犀草素200 mg/kg組和地塞米松組病變較模型組有所改善，肺泡腔逐漸清晰，肺組織間炎性細胞浸潤明顯減輕。見圖2。

2.4 木犀草素對肺組織中p65、IκB-α、pIκB-α的表達的影響NFκB信號通路調控了眾多炎性細胞因子基因的表達，NFκB p65和IκB-α、pIκB-α的Western blot結果顯示如圖3。造模3 h后，和正常組相比，模型組中P65的表達量顯著提高;和模型組相比，木犀草素和地塞米松不同程度的降低了P65的表達。進一步研究發現，ALI模型組中啟動炎性反應的p IκB-α表達量顯著增加，IκB-α表達量顯著降低，而木犀草素和地塞米松卻抑制了pIκB-α的表達，促進了IκB-α的表達。見圖3。

圖1 木犀草素對ALI小鼠Ri、Re及Cdyn的影響

圖2 木犀草素對小鼠ALI肺組織病理學的影響(HE×200)

圖3 木犀草素抑制了NFκB的活化和IκB-α的磷酸化

3 討論

內毒素是革蘭氏陰性細菌細胞壁外膜上的脂多糖(LPS)成分，可作為抗原激活機體的免疫應答，激活白細胞，誘使TNFα、IL-1β、IL-6等炎性因子的釋放［6］。LPS直接作用于肺組織，破壞肺泡引起出血、肺水腫，使壞死組織、炎性細胞堆積，促使肺泡巨噬細胞和炎性反應鏈的激活，導致肺內炎性反應［7］。近年來，為研究吸入性急性肺損傷，動物模型大多數是用LPS氣道穿剌滴入造模。來源于革蘭陰性菌外壁的LPS滴注小鼠后，BALF中細胞因子含量顯著升高，毛細血管通透性增加和肺功能的變化等表明ALI造模成功［8，9］。后兩項指標的變化可間接表明肺表面活性物質的代謝發生改變。

王旭光等［10］采用ELISA檢測木犀草素對PGE2生成的影響，結果發現木犀草素抑制LPS誘導的RAW264.7細胞(小鼠單核/巨噬細胞系)PGE2的生成，同時下調LPS誘導的RAW264.7細胞環氧合酶2 (COX-2)及mPGES-1mRNA和蛋白的表達，這可能是木犀草素抗炎的機制之一。范文輝等［11，12］通過建立哮喘氣道重塑模型，分別使用地塞米松及木犀草素進行干預，觀察支氣管肺泡灌洗液中白細胞介素-5和γ干擾素水平的變化，得出結論木犀草素有顯著的抗氣道重塑作用。同時發現木犀草素抑制氣道重塑的作用機制為抑制氣道白細胞介質13受體α2(IL-13Rα2)的表達。張毅等［13］研究木犀草素對LPS誘導的RAW264.7細胞核因子κB(NF-κB)和COX-2表達及NF-κB DNA結合活性的影響，結果發現木犀草素能顯著性抑制LPS誘導的RAW264.7細胞PGE2的生成，降低NF-κB的DNA結合活性，下調LPS誘導的RAW264.7細胞COX-2mRNA、NF-κB和COX-2蛋白的表達。這些研究結果提示，木犀草素可能對ALI具有保護作用。

本研究結果顯示，木犀草素能明顯抑制脂多糖誘導的急性肺損傷小鼠的Ri、Re增長和Cdyn降低，抑制BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α的釋放，減輕了肺部病變，抑制了NFκB p65和pIκB-α的活化。這表明木犀草素對LPS誘導的小鼠急性肺損傷具有保護作用。

TNF-α和IL-1β是ALI早期兩個重要的前炎性因子［14］。在炎性反應初期，TNF-α除能動員血循環中的PMN向炎癥部位聚集外，還能動員骨髓白細胞進入血液循環，同時激活內皮細胞。內皮細胞受TNF-α刺激時，釋放E選素、L選擇素、細胞間黏附分子1和血管黏附因子1等黏附因子，進一步誘導IL-1、IL-6、IL-8、CSF等細胞因子的分泌，共同參與炎性反應。當PMN被激活后，TNF-α又能增強PMN的吞噬能力，促進PMN脫顆粒和釋放溶酶體，增強PMN呼吸爆發，產生大量脂質代謝產物，破壞毛細管內皮細胞的屏障功能，增加肺毛細血管的通透性，刺激內皮細胞釋放大量組織因子，同時抑制纖溶活性，損害毛細血管的抗凝功能。這些促炎因子作為重要的信號因子，進一步啟動、放大和延續全身或局部炎性反應，呈現級聯反應，最終導致炎癥失控。本研究表明木犀草素能明顯的降低了TNF-α、IL-1β和IL-6等細胞因子的含量，其中200 mg/kg作用效果更顯著。

目前研究證實，與炎癥和免疫反應關系密切的許多細胞因子、黏附分子基因啟動部位均含有核因子NF-κB位點。NF-κB對細胞因子網絡具有廣泛的調控作用，能夠調控多種細胞因子的基因轉錄。NF-κB的主要形式為p50和p65組成的二聚體，p50是與DNA結合的部位，p65參與基因轉錄的超始調節，p65是NF-κB的主要活性形式，并可促進p50與DNA結合，當p65與細胞質內抑制蛋白IκB結合，可掩蓋p50上核定位信號，僅有p65蛋白C末含有轉錄激活區域，能夠直接啟動基因的轉錄［15，16］。NF-κB一般存在于細胞質中，同IκB僅緊密結合，卻不發揮作用。在IL-1、TNF、LPS等炎性介質作用下，細胞質內IκB激酶被激活，導致IκB被磷酸化，進而由蛋白酶降解，使IκB發生降解、磷酸化，多聚體上的IκB分子的2個絲氨酸磷酸化、泛素化而降解，NF-κB則從多聚體上釋放，進入細胞核與DNA特定靶κB部位結合，調控特定基因轉錄［17］。本研究提示木犀草素保護急性肺損傷中降低了P65的表達同時抑制了pIκB-α的表達，同時促進了IκB-α的表達。本研究說明木犀草素對NFκB信號通路的調控在急性肺損傷的保護中起到了重要作用，是否和其他細胞信號通路有關目前尚不清楚，有待進一步研究。

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Study on protective effects and its imechanism of luteolin on acute lung injury induced by lipopolysaccharide in m ice

DAI Li，DUAN Limei，YAO Zhiqing.Dental Hospital of Medical School，Nanjing University，Nanjing 210008，China

ObjectiveTo investigate the effect of luteolin on acute lung injury(ALI)induced by lipopolysaccharide (LPS)in mice，and to explore possible action mechanism.M ethodsNinety-six mice were random ly divided into 6 groups: notmal control group，model group，luteolin low-dose group luteolin median-dose group luteolin high-dose group，dexamethasone control group，with 8 mice in each group.The animal models with ALI were established by injecting LPS into airway of mice，then the changes of lung airway inspiratory resistance(Ri)，expiratory resistance(Re)and dynamic lung compliance(Cdyn) were detected by pulmonary function test apparatus.The levels of IL-1β，IL-6，TNF-α in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) were determined by ELISA.The pathological sections were made，and the histopathological changes were observed under light microscope.The expression levels of NF-κB p65，IκB-α and PIκB-α in lung tissues were detected by Western blotting.ResultsLuteolin could obviously inhibit Ri，Re and reduce Cdyn，and could significantly decrease the concentrations of IL-1β，IL-6 and TNF-α in BALF(P＜0.05)，as a result，which could relieve lung injury，moreover，luteolin could inhibit the activation of NF-κB p65 and PIκB-α.ConclusionLuteolin has a protective effect on ALI induced by LPS in mice，and its action mechanism is correlated to inhibiting the expression of NF-κB signal transduction pathway.

luteolin;acute lung injury;lipopolysaccharide;pulmonary function

R 563

A

1002－7386(2015)03－0339－04

2014－09－15)

10.3969/j.issn.1002－7386.2015.03.004

210008南京市，南京大學醫學院附屬口腔醫院