應用高效液相色譜法測定清熱利膽合劑中綠原酸的含量分析

陳 瑾

(四川省醫學科學院·四川省人民醫院藥劑科，四川 成都 610072)

應用高效液相色譜法測定清熱利膽合劑中綠原酸的含量分析

陳 瑾

(四川省醫學科學院·四川省人民醫院藥劑科，四川 成都 610072)

目的 評價高效液相色譜(HPLC)法測定清熱利膽合劑中綠原酸含量的效果。方法 采用HPLC法對4個清熱利膽合劑樣品(批號：140109、140412、140609、140714)中綠原酸的含量進行測定。結果 綠原酸進樣量在220.4～2204 ng有良好的線性關系(r=0.9999)；平均回收率為99.63%，RSD為0.78%。結論 HPLC法測定清熱利膽合劑中綠原酸的含量簡便快速，結果準確、可靠，可用于該制劑的質量控制。

清熱利膽合劑；綠原酸；高效液相色譜法

清熱利膽合劑為本院自制制劑(川藥制字Z20080172)，主要由忍冬藤、茵陳、金錢草、郁金和大黃等中藥組成，具有清熱、利膽的作用，臨床用于膽囊炎的治療。綠原酸為忍冬藤和金錢草中的主要成分，具有抗菌、抗病毒等功效[1]。為控制本品的內在質量，本實驗選擇綠原酸為質控指標，采用HPLC法進行測定，有利于其臨床療效的穩定性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 LC-20AD型高效液相色譜儀(日本島津)，配備LC-20AD泵，SIL-20A型自動進樣器，和SPD-M20A型二極管陣列檢測器(190～800 nm)；AUW 220D型雙量程分析天平(日本島津，感量：0.1 mg/0.01 mg)。綠原酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-200413，供含量測定用)；清熱利膽合劑(醫院自制，批號：140109、140412、140609、140714)；甲醇為色譜純HPLC專用試劑，其他試劑為分析純，水為純化水。

1.2 方法 ①對照品溶液的制備：精密稱取經60 ℃干燥至恒重的綠原酸對照品約10 mg，置100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。②供試品溶液的制備：精密量取本品1 ml，置25 ml棕色量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。③陰性對照溶液的制備：另取處方量藥品(除忍冬藤和金錢草外)，按質量標準規定工藝制成陰性對照制劑，按②項下方法制成陰性對照溶液。④色譜條件和系統適用性試驗：色譜柱：Agilent C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：以乙腈-0.4%磷酸溶液為流動相，按表1中的方法進行梯度洗脫；流速1 ml/min；檢測波長328 nm，柱溫40 ℃；進樣量10 μl；理論板數按綠原酸峰計算不低于1000。⑤空白干擾試驗：分別精密量取綠原酸對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μl，注入液相色譜儀，測定。⑥線性關系：精密稱取干燥至恒重的綠原酸對照品11.02 mg，置50 ml棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。分別精密量取對照品儲備液1.0、2.0、3.0、5.0 ml，分別置10 ml棕色量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得系列對照品溶液。分別精密量取上述4種濃度溶液和對照品儲備液各10 μl注入液相色譜儀，按第④項色譜條件進行測定。以綠原酸峰面積(Y)對濃度(X， μg/ml)繪制標準曲線并計算回歸方程。⑦重復性試驗：取同一批清熱利膽合劑(批號：140609)，按第②項下制備方法平行制備6份供試品溶液，按第④項色譜條件進行測定。⑧中間精密度試驗：分別在不同的日期，用不同的分析儀器(美國安捷倫1100型HPLC儀)，由不同的分析人員按第②項下方法分別配制3份供試品溶液，按照第④項色譜條件測定。⑨供試品溶液的穩定性試驗：取第⑦項下的供試品溶液1份，于室溫(20～25 ℃)下放置，在不同時間段(0、2、4、6、8、10 h)分別進樣。⑩加樣回收率試驗：精密量取9份已知含量的同一批號供試品溶液(批號：140609，含量為1.19 mg/ml)25 ml，分別置50 ml棕色量瓶中，分別精密加入綠原酸對照品溶液(濃度為0.241 mg/ml)4、5、6 ml，每個濃度平行三份，混合均勻后制成含綠原酸80%、100%及120%的樣品溶液，再按第②項下方法制備供試品溶液。分別精密量取上述供試品溶液各10 μl，按④項色譜條件測定。

表1 梯度洗脫程序

2 結果

2.1 空白干擾試驗 見圖1。供試品溶液色譜圖中有與對照品溶液色譜圖中綠原酸色譜峰相對應的色譜峰，并且該色譜峰與其他色譜峰的分離度大于1.5，陰性對照溶液在與綠原酸對照品色譜峰相同保留時間處無色譜峰，即其它藥材對綠原酸的含量測定無影響。

圖1 綠原酸含量測定HPLC色譜圖 a：對照品溶液；b：供試品溶液；c：陰性對照溶液；1：綠原酸峰

2.2 線性關系 線性回歸曲線：Y=28213X + 20828(r=0.9999)。結果表明，綠原酸進樣量在220.4～2204 ng線性關系良好。

2.3 重復性 樣品中綠原酸的平均含量為1.19 mg/ml，RSD為0.44%。

2.4 中間精密度試驗 綠原酸的平均含量為1.19 mg/ml，RSD為0.56%。

2.5 供試品溶液的穩定性試驗 綠原酸峰面積的RSD為0.61%，表明供試品溶液于室溫放置10 h內含量穩定。

2.6 加樣回收率試驗 綠原酸的平均回收率為99.63%，RSD為0.78%(n=9)，見表2。

表2 綠原酸加樣回收率試驗結果 (n=9)

2.7 綠原酸含量 取不同批號的清熱利膽合劑，按第②項下制備方法制備并測定綠原酸含量，見表3。

表3 樣品綠原酸含量測定結果 (n=3)

3 討論

本研究選擇綠原酸為主要質控指標，對清熱利膽合劑的質量進行控制，為其臨床療效的穩定性提供參考。文獻報道關于綠原酸的HPLC含量測定方法，多采用等度洗脫法，如乙腈-水-甲酸(9∶91∶0.1)[2]，乙腈-0.05%磷酸(10∶90)[3]。由于合劑中所含藥材種類較多，成分復雜，采用常規等度洗脫方法不能將綠原酸與其他成分進行有效分離。我們采用乙腈-0.04%磷酸溶液梯度洗脫，主要成分均可在30 min內出峰，綠原酸色譜峰形較好，且與合劑中其他成分分離良好。本研究所建立的方法操作簡單，結果準確可靠，可用于清熱利膽合劑的質量控制，同時也可為類似的其他制劑中綠原酸的含量測定提供借鑒。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：化學工業出版社，2010：179.

[2] 胡志國，王遠興，陳振桂，等.反相高效液相色譜法測定山楂中綠原酸的含量[J].食品科學，2007，28(11)：407-410.

[3] 曹金枝，蘇志剛.HPLC法測定復方魚腥草片中綠原酸的含量[J].首都醫藥，2014，20：93-94.

HPLC determination of chlorogenic acid content in Qingre Lidan Mixture

CHEN-Jin

(Department of Pharmacy，Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People’s Hospital，Chengdu 610072，China)

Objective To investigate the efficacy of HPLC method in determination of chlorogenic acid content in Qingre Lidan Mixture.Methods The contents of chlorogenic acid in four samples(Lot.140109，140412，140609 and 140714)of Qingre Lidan Mixture were measured by a HPLC method.Results The chlorogenic acid injection volume of 220.4～2204 ng had a fine linear relationship(r=0.9997).The rate of average recovery was 99.63% and RSD was 0.78%.Conclusion This method is proved to be simple and rapid.The result is accurate and reliable.It is suitable for the quality control of Qingre Lidan Mixture.

Qingre Lidan Mixture；Chlorogenic acid；HPLC

R284.1

A

1672-6170(2015)05-0139-03

2014-11-25；

2015-06-30)