細胞毒T淋巴細胞相關抗原4基因多態性與宮頸癌的相關性研究

王甲甲，王智斌，黃文芳

(四川省醫學科學研究院·四川省人民醫院檢驗科，四川 成都 610072)

細胞毒T淋巴細胞相關抗原4基因多態性與宮頸癌的相關性研究

王甲甲，王智斌，黃文芳

(四川省醫學科學研究院·四川省人民醫院檢驗科，四川 成都 610072)

目的 探討細胞毒T淋巴細胞抗原4(cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CTLA-4)-318 T/C、CT60 G/A、+49 G/A基因多態性與宮頸癌之間的相關性。方法 選取2012年12月至2014年7月292例宮頸癌患者(患者組)，及同期355例健康體檢者(對照組)，采集研究對象外周靜脈血5 ml，抽提全血基因組DNA，PCR擴增后直接測序法檢測CTLA-4-318 T/C，CT60 G/A，+49 G/A基因多態性的分布。結果 Logistic回歸分析顯示，-318CC和CT60 AA基因型均與宮頸癌發病相關(P< 0.05)。與對照組比較，攜帶CTLA-4-318T、CT60 g等位基因的宮頸癌患者明顯增加(均P< 0.05)；攜帶CTLA-4 +49 gG基因型、+49A等位基因的宮頸癌患者，差異無統計學意義(P> 0.05)。結論 CTLA-4-318、CT60基因多態性與宮頸癌發病有關。

CTLA-4；基因多態性；宮頸癌

宮頸癌是女性的第二大常見的惡性腫瘤[1]。人類乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是公認的宮頸癌的高危因素，近90%的宮頸癌患者均可檢測到HPV感染，然而，并非所有感染HPV的病例均會發展為宮頸癌，這意味著環境因素、遺傳學或免疫學等因素可能在宮頸癌的發生過程中也起著關鍵的作用[2，3]。有學者認為，宮頸癌患者體內存在抑制性免疫微環境，特別是在年輕患者和病情嚴重患者更為明顯，其中T細胞表面的細胞毒T淋巴細胞相關抗原4(cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CTLA-4)分子發揮重要作用[4]。人類CTLA-4基因定位于2號染色體長臂33帶(2q33)，主要表達在活化的T細胞上，它可與抗原提呈細胞表面的B7分子結合并抑制T細胞的增殖與活化，其單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)與乳腺癌、黑色素瘤、腎癌等人類腫瘤的發生均有密切的關系[5～7]。為了驗證CTLA-4基因遺傳多態性是否與宮頸癌的發生相關，我們選擇了CTLA-4-318 T/C，CT60 G/A，+49 G/A位點進行對照研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2012年12月至2014年7月在四川省人民醫院就診且病理學確診為鱗癌的宮頸癌患者292例作為患者組，均為新發病例，年齡25～72歲，無任何治療經歷。同期355例健康體檢人員作為對照組，無癌癥病史，無任何宮頸上皮病變，宮頸細胞學檢查陰性，宮頸分泌物HPV檢查陰性。通過填寫調查問卷的方式獲取各研究對象的臨床病理學信息，本研究獲得醫院醫學倫理學委員會批準，臨床資料及標本采集均獲患者知情同意。除HPV 感染率外，兩組其他基線資料比較，差異均無統計學意義(P> 0.05)，見表1。

表1 兩組基線資料比較 [n(%)]

1.2 研究方法

1.2.1 標本的獲取與保存 采集各研究對象空腹靜脈血5 ml于乙二胺四乙酸(EDTA-K2)抗凝管中，用全血基因組小量抽提試劑盒提取全血DNA，操作步驟按照試劑盒說明書進行，置于-80 ℃冰箱凍存備用。

1.2.2 引物設計與合成 根據Genbank中CTLA-4-318 T/C，CT60 G/A，+49 G/A的序列號(分別為rs5742909，rs3087243，rs231775)，用Primer premier 5.0軟件設計引物，引物的具體信息見表2，由上海生工公司合成。

1.2.3 HPV基因型的檢測 取各研究對象宮頸脫落細胞用導流雜交法(凱普公司人乳頭瘤病毒核酸擴增分型檢測試劑盒)檢測感染的HPV基因型。

1.2.4 CTLA-4-318 T/C，CT60 G/A，+49 G/A基因多態性的檢測 PCR體系組成如下(20 μl)：基因組DNA 2 μl(約0.2 μg)，10×PCR緩沖液2 μl，25 mM MgCl2溶液2 μl，10 mM dNTPs 2 μl，1 U/ μl Taq DNA聚合酶2 μl和5 μmol/L上、下游引物各1 μl，滅菌ddH2O 8 μl。PCR反應程序如下：94 ℃預變性2 min；94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，30個循環；72 ℃ 再延伸5 min。擴增產物行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，確定PCR產物為目的片段，且無非特異性擴增后，送上海生工公司進行DNA測序。

1.3 統計學方法 采用SPSS 13.0軟件和SHEsis在線平臺進行數據分析。計數資料比較采用卡方檢驗；SHEsis在線平臺計算各位點間的連鎖不平衡并進行組間單倍型頻率的比較；相關因素的探討采用Logistic回歸分析。檢驗標準α=0.05。

2 結果

2.1 遺傳平衡檢驗 CTLA-4-318 T/C、CT60 G/A、+49 G/A基因型經遺傳平衡檢驗，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P> 0.05)，具有群體代表性。

2.2 Logistic多元回歸分析 基因多態性與宮頸癌的關系 Logistic回歸分析顯示，-318CC和CT60 AA基因型均與宮頸癌發病有關(P< 0.05)。與對照組比較，攜帶CTLA-4-318 T、CT60 G等位基因的宮頸癌患者明顯增加(χ2分別為13.482和14.138，均P<0.05)；攜帶CTLA-4 +49 gG基因型、+49A等位基因的宮頸癌患者，差異無統計學意義(P> 0.05)，見表3。

表2 CTLA-4-318 T/C，CT60 G/A，+49 G/A引物的基本信息

2.3 CTLA-4基因多態性單倍型與宮頸癌發生的關系 不同CTLA-4-318 T/C和CT60 G/A單倍型攜帶者與宮頸癌發病風險關系的結果見表4，CTLA-4-318 C/CT60 A單倍型者發生宮頸癌的風險低于CTLA-4-318 T/CT60 G單倍型攜帶者(P<-0.05)，而CTLA-4-318 C/CT60 G，-318 T/CT60 A單倍型攜帶者發生宮頸癌的風險與CTLA-4-318 T/CT60 G單倍型者差異無統計學意義(P> 0.05)。

表3 CTLA-4 SNPs 在兩組的分布情況

表4 CTLA-4基因多態性單倍型與宮頸癌發病風險的關系

3 討論

CTLA-4是細胞表面共刺激分子，與CD28分子屬于同一家族，均可與B7細胞表面分子相結合，在T細胞介導的自身免疫性疾病的遺傳易感性上起重要作用[8]。CD28/B7復合物與CT LA-4/B7復合物在T細胞反應機制上的作用截然相反，前者能夠促進T細胞發生免疫應答，而后者對免疫反應起下調和抑制作用[9]。Janeway等[10]提出T細胞激活的雙信號理論，第一信號由T細胞受體TCR與MHC抗原肽的結合提供，第二信號由APC表面的共刺激分子與T細胞表面相應受體結合而提供。CTLA-4作為CD28的拮抗劑，競爭性與APC表面的相應配體B7結合，從而下調T細胞的反應，是傳遞第二信號的重要分子。大量文獻報道，CTLA-4基因多態性與自身免疫性疾病的發生密切相關，近年來，CTLA-4基因多態性與腫瘤發生之間的關系得到了越來越多的關注，本研究即旨在探討CTLA-4-318 T/C，CT60 G/A，+49 G/A基因多態性與宮頸癌發病的相關性。

挑選292例宮頸癌患者和355例年齡匹配的健康對照者參與本研究。由于HPV感染與宮頸癌的發生關系密切，所有參與對象均需進行常規的HPV DNA檢測，結果發現，87.0%的宮頸癌患者HPV檢測均為陽性，這與其他研究報道結果基本一致[11]。采集各參與者的外周血，分別對292例宮頸癌患者和355例健康對照者進行CTLA-4 SNPs(-318 T/C，CT60 G/A，+49 G/A)的檢測，結果發現，-318CC和CT60 AA基因型均與降低宮頸癌發病風險有關，與對照組比較，攜帶CTLA-4-318 T、CT60 G等位基因的宮頸癌患者明顯增加。相反，CTLA-4 +49 G/A基因多態性與宮頸癌發生無相關關系(P> 0.05)。有報道卻認為，CTLA-4 +49基因多態性與宮頸癌發生有密切關系，這可能與種族差異、樣本量大小等有關[12]。

單倍型是指一條染色體上緊密連鎖的多個等位基因的線性排列。SNP單倍型就是不同SNPs位點上核苷酸堿基的線性排列，每一種線性排列稱為一種SNP單倍型。理論上講單倍型出現的頻率應是各個基因頻率的乘積，但事實卻非如此，連鎖的單倍型并不是隨機組合的，而是某些基因更多或更少的連鎖在一起，即所謂的“連鎖不平衡”。在探討基因與疾病的相關性時，單倍型分析可能提供更多的信息，有利于更精確和客觀地分析疾病的遺傳易感性。由于前述研究結果認為，CTLA-4 +49 G/A基因多態性與宮頸癌的發生無明顯的相關性，該研究僅對CTLA-4-318 T/C，CT60 G/A基因多態性位點是否存在連鎖不平衡進行分析，結果發現，CTLA-4-318 C/CT60 A與降低宮頸癌的發病風險有關，提示這兩個多態性位點可能存在連鎖不平衡。

綜上所述，本研究認為CTLA-4-318 T/C，CT60 G/A基因多態性與宮頸癌的發病風險相關。然而我們的結果需要進一步擴大樣本量和種族進行驗證。對于CTLA-4基因多態性的研究將有助于預測宮頸癌的發病風險，提高宮頸癌的預防及早期診斷水平。

[1] Fujiwara H，Shimoda A，Ishikawa Y，et al.Effect of providing risk information on undergoing cervical cancer screening：a randomized controlled trial[J].Arch Public Health，2015，73(1)：7.

[2] Fontenot HB.Urine-Based HPV Testing as a Method to Screen for Cervical Cancer[J].Nurs Womens Health，2015，19(1)：59-65.

[3] Lata K，Bhatla N.HPV testing for cervical cancer screening：Time for a new paradigm[J].Natl Med J India，2014，27(4)：212-213.

[4] Lee YH，Song GG.A meta-analysis of the association between CTLA-4 +49 A/G，-318 C/T，and IL-1 polymorphisms and susceptibility to cervical cancer[J].Neoplasma，2014，61(4)：481-490.

[5] Li D，Zhang Q，Xu F，et al.Association of CTLA-4 gene polymorphisms with sporadic breast cancer risk and clinical features in Han women of northeast China[J].Mol Cell Biochem，2012，364(1-2)：283-290.

[6] Bouwhuis MG，Gast A，Fig A，et al.Polymorphisms in the CD28/CTLA4/ICOS genes：role in malignant melanoma susceptibility and prognosis[J].Cancer Immunol Immunother，2010，59(2)：303-312.

[7] Cozar JM，Romero JM，Aptsiauri N，et al.High incidence of CTLA-4 AA(CT60)polymorphism in renal cell cancer[J].Hum Immunol，2007，68(8)：698-704.

[8] 陳水連，鄧斐，江峰，等.CTLA-4啟動子區基因多態性與系統性紅斑狼瘡關系的meta分析[J].細胞與分子免疫學雜志，2012，28(12)：1320-1323.

[9] Leung J，Suh WK.The CD28-B7 Family in Anti-Tumor Immunity：Emerging Concepts in Cancer Immunotherapy[J].Immune Netw，2014，14(6)：265-276.

[10]Janeway CA，Bottomly K.Signals and signs for lymphocyte responses[J].Cell，1994，76(2)：275-285.

[11]Xiong YH，He L，Fei J.Genetic variations in cytotoxic T-lymphocyte antigen-4 and susceptibility to cervical cancer[J].Int Immunopharmacol，2014，18(1)：71-76.

[12]Lee YH，Song GG.A meta-analysis of the association between CTLA-4 +49 A/G，-318 C/T，and IL-1 polymorphisms and susceptibility to cervical cancer[J].Neoplasma，2014，61(4)：481-490.

The correlation of cytotoxic T lymphocyte antigen 4 polymorphisms with occurrence of cervical cancer

WANG Jia-jia，WANG Zhi-bin，HUANG Wen-fang

(Clinical Laboratory，Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People’s Hospital，Chengdu 610072，China)

Objective To explore the correlation between cytotoxic T lymphocyte antigen 4(CTLA-4)genotypes-318 T/C，CT60 G/A，+49 G/A and occurrence of cervical cancer.Methods Two hundred and ninety-two patients with cervical cancer from December 2012 to July 2014 were selected as study group，and 355 cases of healthy controls were recruited as control group.Peripheral blood of each participant was collected and genomic DNA was extracted.The distribution of CTLA-4-318 T/C，CT60 G/A，+49 G/A genotypes were detected by direct sequencing.Results The CTLA-4-318 CC and CT60 AA genotypes were correlated with the decrease of cervical cancer risk(P< 0.05).Compared with control group，the frequencies of CTLA-4-318T allele and CT60 g allele carriers were significantly higher in the cancer patients(P< 0.05).No significant differences were found in the genotype and allele frequencies in +49 G/A between patients and healthy controls(P> 0.05).Conclusion The polymorphisms of CTLA-4-318 and CT60 are correlated with cervical cancer risk.

CTLA-4；Genetic polymorphisms；Cervical cancer

R446.62

A

1672-6170(2015)05-0077-04

2015-02-26；

2015-04-30)