布洛芬對兔骨關節炎模型Wnt/β-catenin信號通路和軟骨細胞基質代謝的影響

劉洪彥，鄭 毅

(首都醫科大學附屬北京朝陽醫院風濕免疫科，北京 100020)

布洛芬對兔骨關節炎模型Wnt/β-catenin信號通路和軟骨細胞基質代謝的影響

劉洪彥，鄭 毅

(首都醫科大學附屬北京朝陽醫院風濕免疫科，北京 100020)

目的 探討布洛芬對兔骨關節炎(osteoarthritis，OA)模型膝關節軟骨細胞基質代謝及Wnt/β-catenin信號通路的影響。方法 采用改良伸直位固定法制作兔OA模型，分離提取兔OA模型膝關節軟骨細胞進行培養。采用四唑鹽比色法選擇布洛芬和二甲基亞砜(DMSO)實驗濃度。確定實驗濃度后將軟骨細胞分為DMSO組和布洛芬組，分別給予1%DMSO和250 μM布洛芬干預48 h后，采用real-time PCR法和ELISA方法檢測軟骨細胞Wnt/β-catenin相關因子(β-catenin、MMP-13、ADAMTS-4、II型膠原和蛋白聚糖)mRNA及蛋白的水平。結果 DMSO對照組和布洛芬組β-catenin、MMP-13、ADAMTS-4、II型膠原和蛋白聚糖的mRNA及蛋白水平比較，差異均無統計學意義(P> 0.05)。結論 兔OA模型膝關節軟骨細胞中，布洛芬對Wnt/β-catenin信號通路和軟骨細胞基質代謝無明顯影響。

骨關節炎；Wnt/β-catenin信號通路；基質代謝；布洛芬

骨關節炎是(osteoarthritis，OA)是一種由多種原因所致的慢性退行性關節病變。研究顯示，Wnt/β-catenin信號通路是參與骨和軟骨代謝的重要信號通路，在OA中發揮重要作用。另有研究顯示，非甾體類抗炎藥(NSAIDs)可通過抑制Wnt信號通路發揮抗腫瘤作用，而此通路下游基因和蛋白表達可影響關節軟骨生長代謝，在OA發生發展中有重要作用[1，2]。據此提出假設，在OA中，NSAIDs可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路對OA軟骨細胞代謝發揮作用。為驗證此假說，本研究以布洛芬為例進行了相關研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 6月齡健康普通級新西蘭大耳兔8只(北京房山動物養殖廠提供)，雄性，體重2～2.5 kg，復合飼料喂養。DMEM-F12細胞培養液，Hyclone公司；胎牛血清，元亨生物公司；TRIZOL，Invitrogen life technologies公司；RNAsimple總RNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司；cDNA合成反轉錄試劑盒，加拿大MBI Fermentas公司；SYBR Green PCR Master Mix，美國Applied Biosystems公司；ELISA試劑盒，武漢華美。一抗和二抗，北京博奧森生物有限公司。

1.2 細胞準備 適應性喂養1周后，采用改良伸直位固定法[3]制作兔OA模型，造模7周。造模完成后處死家兔，無菌條件下取造模膝關節軟骨組織，應用分階段酶消化法分離軟骨細胞，用含20%FBS的DMEM-F12，37 ℃，5% CO2進行培養。

1.3 藥物濃度選擇 取生長良好的第二代OA軟骨細胞，分為正常對照組、DMSO組和布洛芬組。正常對照組不予處理，DMSO和布洛芬組設置高中低三種藥物濃度梯度，分別為DMSO 1%、0.1%與0.01%，布洛芬1000、500、250 μM，參照試劑盒說明書，應用四唑鹽(MTT)比色法檢測各濃度梯度內對兔OA軟骨細胞活性的影響。取不同兔的第二代軟骨細胞重復上述實驗1次，計算2次實驗中每種藥物濃度組光吸收值的平均值。

與正常對照組(0.162±0.014)相比，高濃度和中濃度布洛芬組光吸收值(OD值)明顯降低(P< 0.05)，而不同濃度DMSO組與對照組差異無統計學意義(P> 0.05)，結果見表1。參考文獻，選擇對細胞無明顯毒性作用并與血藥濃度相近的較高藥物濃度進行藥物干預實驗。故最終選擇布洛芬250 μM和DMSO 1%為實驗濃度。

表1 布洛芬對骨關節炎軟骨細胞活性的影響

*與對照組相比，P< 0.05

1.4 ELISA方法檢測蛋白水平 將軟骨細胞分為DMSO組和布洛芬組。取二代OA軟骨細胞進行培養，分別加入選擇實驗濃度的DMSO和布洛芬培養48 h。取細胞上清液采用ELISA方法檢測蛋白水平，具體步驟嚴格按ELISA說明書進行。

1.5 RT-PCR方法檢測基因水平 兩組細胞經DMSO和布洛芬干預培養48小時后棄上清液，用PBS清洗2遍后，加入1 ml TRIZOL反復吹打，參照試劑說明書完成RNA提取和逆轉錄反應。PCR反應引物設計如表2。應用SYBR Green PCR Master Mix在7300型熒光定量PCR儀進行熒光定量RT-PCR，檢測各因子mRNA水平。實驗中所有樣本均設三復孔。反應體系：cDNA 2 μl，Primer 1(10 μM)1 μl，Primer 2(10 μM)1 μl，2×SYBR Green qPCR Mix 5 μl，dd H2O 1 μl。反應條件：50 ℃，2 min； 94 ℃，10 min； 95 ℃，15 s；60 ℃，1 min 30個循環。獲得擴增曲線和溶解曲線。mRNA相對表達量采用2-ΔΔCT進行計算，ΔCT=CT(目的基因)-CT(內參基因)。CT值代表每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數。

表2 Wnt/β-catenin通路相關因子引物序列

1.6 統計學方法 采用SPSS 17.0進行統計分析。計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 布洛芬對兔OA軟骨細胞基質代謝的影響 與DMSO組相比，布洛芬組細胞培養上清液中Ⅱ型膠原和蛋白聚糖蛋白水平差異無統計學意義(P> 0.05)。與DMSO組相比，布洛芬組軟骨細胞中Ⅱ型膠原和蛋白聚糖基因表達水平差異無統計學意義(P> 0.05)，見表3。

表3 布洛芬對OA軟骨細胞上清液中軟骨基質蛋白的影響

2.2 兩組Wnt/β-catenin信號通路相關因子mRNA及蛋白水平的比較

2.2.1 兩組β-catenin mRNA及蛋白水平的比較 兩組軟骨細胞內β-catenin mRNA和β-catenin蛋白水平差異無統計學意義(P> 0.05)(圖1)。兩組軟骨細胞內MMP-13及MMP-13蛋白水平差異無統計學意義(P> 0.05)，見圖2。

2.2.2 兩組MMP-13 mRNA及蛋白水平的比較

2.2.3 兩組ADAMTS-4 mRNA及蛋白水平的比較 兩組軟骨細胞內ADAMTS-4 mRNA和ADAMTS-4蛋白水平差異無統計學意義(P> 0.05)，見圖3。

圖1 兩組兔OA軟骨細胞內β-catenin mRNA和蛋白相對表達量 a：mRNA；b：蛋白水平

圖2 兩組兔OA軟骨細胞內MMP-13 mRNA和蛋白相對表達量 a：mRNA；b：蛋白水平

3 討論

Wnt/β-catenin信號通路在OA中發揮著重要作用，它與骨組織細胞分化、生長、凋亡、死亡、骨量調節等多個病理生理過程有關[4，5]。研究發現，Wnt/β-catenin通路的異常使骨骼系統代謝失衡，可導致OA的發生[6]，此信號通路靶基因包括參與細胞增殖、凋亡、炎癥和基質代謝的基因，其中包括MMPs、ADAMTS等，對OA軟骨代謝具有重要作用[7，8]。

圖3 兩組兔OA軟骨細胞ADAMTS-4 mRNA及蛋白相對表達量 a：mRNA；b：蛋白水平

NSAIDs作為緩解OA癥狀的重要藥物，NSAIDs主要作用機制是抑制環氧化酶(cyclooxygenase，COX)活性，減少炎癥因子前列腺素的合成，從而減輕或控制炎癥反應。根據對COX-1和COX-2的選擇性，分為非選擇性NSAIDs和選擇性NSAIDs，前者同時抑制COX-1和COX-2，而后者更有針對性地抑制COX-2。本實驗中研究用藥布洛芬屬于非選擇性COX抑制劑。研究發現，NSAIDs可通過抑制Wnt/β-catenin通路發揮腫瘤預防作用[9，10]，而其下游靶基因在OA軟骨代謝中發揮重要作用。那么，NSAIDs對軟骨的作用是否能夠通過Wnt/β-catenin來調節，經文獻檢索，未發現相關文獻報道。故本研究從細胞水平探討布洛芬對軟骨細胞基質代謝的作用以及Wnt/β-catenin信號通路在其中可能發揮的作用。

本研究分別采用布洛芬250 、500、1000 μM進行藥物毒性實驗，結果發現后兩者均對OA軟骨細胞產生不同程度的毒性作用，故選擇布洛芬250 μM為最終濃度。另外，由于所選擇的實驗用藥布洛芬在合成過程中添加了DMSO溶劑，為了排除DMSO對實驗的干擾，對DMSO在濃度為0.01%、0.1%和1%時進行細胞活性檢測，結果發現各濃度DMSO對OA軟骨細胞的活性均無影響。由于藥物中DMSO的濃度更接近1%，故以此為對照，以排除后續實驗中DMSO的干擾。

本研究發現，經布洛芬干預后，OA軟骨細胞內II型膠原和蛋白聚糖無明顯變化。提示布洛芬對兔OA軟骨基質代謝無明顯影響。臨床上，布洛芬廣泛用于緩解OA疼痛癥狀。有個別研究顯示布洛芬對軟骨基質代謝具有抑制作用[11]，這使得臨床醫生在應用布洛芬治療OA時產生了遲疑。而本實驗發現布洛芬對軟骨細胞基質代謝并無抑制作用，為布洛芬治療OA的臨床應用提供了新的理論依據。

本研究結果還發現，經布洛芬干預后，軟骨細胞內β-catenin基因和蛋白及其下游因子MMP-13、ADAMTS-4均無明顯變化。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的關鍵因素。存在Wnt信號時，β-catenin在細胞漿中積累，累積到一定量即進入核內與Lef/Tcf結合可激活下游靶基因轉錄。β-catenin在細胞漿內水平的高低和核內轉移的情況提示了Wnt/β-catenin信號通路的狀態。Wnt/β-catenin通路下游因子MMP-13和ADAMTS-4是與軟骨基質代謝密切相關的因子，前者主要對軟骨基質II型膠原具有促分解作用，而后者主要對蛋白聚糖具有分解作用。此實驗中，經布洛芬干預后β-catenin基因和蛋白均無明顯變化，其下游因子亦無明顯變化，恰與軟骨基質II型膠原和蛋白聚糖未發生變化的結果吻合。上述結果均提示，在OA軟骨細胞中布洛芬對Wnt/β-catenin信號通路無抑制作用，這與NSAIDs在腫瘤中的研究結果不一致。Greenspan等[12]用布洛芬干預SW480結腸癌細胞后發現，布洛芬可抑制細胞中β-catenin的核內轉移，抑制下游靶基因cyclin D1的表達，發揮抗腫瘤作用。而本實驗在OA中的研究并未發現布洛芬對Wnt信號通路的抑制作用。Gareddy在人膠質細胞瘤中的研究也發現NSAIDs塞來昔布可通過抑制Wnt信號通路而抑制人膠質細胞瘤的生長。我們認為OA軟骨細胞和腫瘤細胞中研究結果出現不一致的原因可能如下：①組織細胞差異性。目前NSAIDs對Wnt信號通路的抑制研究僅局限于腫瘤細胞內，未發現在其它組織或細胞內的相關獻報道。腫瘤細胞作為人體內的異常變異的細胞，其在信號通路方面的特殊性可能是導致在OA軟骨細胞中研究與腫瘤細胞內研究結果不一致的原因。②COX-2的依賴性。Smith等[13]的研究也發現，紫外線誘導的COX-2表達與PGE2增加導致β-catenin信號通路的激活，最新研究顯示[14]COX-2抑制劑的應用可以顯著抑制紫外線誘發的β-catenin活化，在NSAIDs通過抑制β-catenin信號通路發揮抗腫瘤作用時，羅非昔布等COX-2特異性抑制劑較COX非特異性抑制劑作用更為顯著[15]，上述結果均提示Wnt/β-catenin信號通路是具有COX-2依賴性的。本實驗中選擇布洛芬為研究藥物，它是一種非選擇性COX抑制劑，對COX-2的抑制作用較弱，這可能是OA中布洛芬未表現出Wnt/β-catenin信號通路抑制性的原因之一。

綜上所述，布洛芬對OA中軟骨細胞基質代謝無明顯影響，為臨床醫生應用布洛芬治療OA提供了進一步的理論依據。另外，布洛芬對Wnt/β-catenin信號通路亦無明顯抑制作用，這可能是與NSAIDs對Wnt/信號通路的抑制作用具有COX-2依賴性有關。

[1] Li N，Xi Y，Tinsley HN，et al.Sulindac selectively inhibits colon tumor cell growth by activating the cGMP/ PKG pathway to suppress Wnt/β-catenin signaling[J].Mol Cancer Ther.2013，12(9)：1848-1859.

[2] Sareddy GR，Kesanakurti D，Kirti PB.Nonsteroidal anti-inflammatory drugs diclofenac and celecoxib attenuates Wnt/β-catenin/Tcf signaling pathway in human glioblastomacells[J].Neurochem Res，2013，38(11)：2313-2322.

[3] 熊勇，張照慶.改良伸直位固定法建立兔膝骨性關節炎模型的研究[J].湖北中醫學院院報，2010，10：19-21.

[4] Frank P.Luyten，PrzemkoTylzanowski，Rik J.Lories.Wnt signaling and osteoarthritis[J].Bone.2009，44：522-527.

[5] Zheng Q，Xu H，Zhang X，et al.Expression and significance ofWnt/β-catenin signaling pathway in vitro natural degenerationmodel of endplatechondrocytesin rats[J].Zhonghua Yi XueZaZhi，2014，94(31)：2464-2467.

[6] Qiuqian Wu，Mei Zhu，Randy N.et al.β-catenin，cartilage，and osteoarthritis[J].Annals of the New York academy of sciences[J].2010，1192：344-350.

[7] Takahito Yuasa，Tomohiro Otani，Tatsuya Koike，et al.Wnt/b-catenin signaling stimulates matrix catabolic genes and activity in articular chondrocytes：its possible role in joint degeneration[J].Laboratory Investigation，2008，88：264-274.

[8] Debbie Y Dao，Jennifer H Jonason，Yongchun Zhang，et al.Cartilage-Specific β-Catenin Signaling Regulates Chondrocyte Maturation，Generation of Ossification Centers，and Perichondrial Bone Formation During Skeletal Development[J].Journal of Bone and Mineral Research，2012，27(8)：1680-1694.

[9] Li N，Xi Y，Tinsley HN，et al.Sulindac selectively inhibits colon tumor cell growth by activating the cGMP/ PKG pathway to suppress Wnt/β-catenin signaling[J].Mol Cancer Ther，2013，12(9)：1848-1859.

[10]Sareddy GR，Kesanakurti D，Kirti PB.Nonsteroidal anti-inflammatory drugs diclofenac and celecoxib attenuates Wnt/β-catenin/Tcf signaling pathway in human glioblastomacells[J].Neurochem Res，2013，38(11)：2313-2322.

[11]Bjelle A，Eronen I.The in vitro effect of six NSAIDs on the glycosaminoglycan metabolism of rabbit chondrocytes[J].Clin Exp Rheumatol，1991，9(4)：369-374.

[12]Greenspan EJ，Madigan JP，Boardman LA.Ibuprofen inhibits activation of nuclear beta-catenin in human colon adenomas and induces the phosphorylation of GSK-3 beta[J].Cancer Prev Res(Phila).2011 4(1)：161-171.

[13]Smith KA，Tong X，Abu-Yousif AO，et al.UVB radiation-induced b-catenin signaling is enhanced by COX-2 expression in keratinocytes[J].MolCarcinog，2012，11(3)：123-129.

[14]Prasad R，Katiyar SK.Ultraviolet radiation-induced inflammation activates β-catenin signaling in mouse skin and skin tumors[J].2014，44(4)：1199-206.

[15]Evans JF.Rofecoxib(Vioxx)，a specific cyclooxygenase-2 inhibitor，is chemopreventive in a mouse model of colon cancer[J].Am J Clin Oncol，2003，26(4)：S62-65.

The role of ibuprofen to Wnt signaling pathway and chondrocytes matrix metabolism in osteoarthritis

LIU Hong-yan，ZHENG Yi

(Department of Rheumatology and Immunology，Beijing Chao-yang Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing 100020，China)

ZHENGYi

Objective To study the metabolism how ibuprofen influence matrix metabolism of rabbit OA chondrocytes and the role of Wnt/β-catenin signaling pathway in this process.Methods Use a modified way of mechanical fixation to make rabbit OA model，separation and extraction of rabbit knee OA chondrocytes and then culture in medium.MTT was used to select the dose of DMSO and ibuprofen.After that，the cultured chondroctyes were divided into nomral control group and ibuprofen group，use ELISA and real-time PCR to detect the protein and gene expression of Wnt/β-catenin signaling pathway related factors including β-catenin，MMP-3，MMP-13，ADAMTS-4，collagen II，proteoglycan.Results There were no differences between normal group and ibuprofen group of Wnt/β-catenin signaling pathway related factors including β-catenin，MMP-3，MMP-13，ADAMTS-4，collagen II and proteoglycan.Conclusion In rabbit OA knee chondrocytes，ibuprofen has no effect on matrix metabolism and Wnt/β-catenin signaling pathway.

Osteoarthritis； Wnt /β-catenin signaling pathway； Matrix metabolism； Ibuprofen

R593.2

A

1672-6170(2015)05-0057-05

國家自然科學基金資助項目(編號：81172855)

鄭 毅，女，主任醫師，教授，博士研究生導師。中華醫學會風濕病分會委員，中國醫師協會風濕免疫科醫師分會常務委員，中國醫師協會內科培訓專業指導委員會主任委員，海峽兩岸醫藥衛生交流協會風濕病專家委員會副主任委員，北京醫學會風濕病分會副主任委員，北京醫師協會風濕免疫專科醫師分會副會長。普通高等教育國家級規劃教材、衛生部規劃教材5年制和8年制臨床醫學專業《內科學》編委。主要研究方向：風濕性疾病診治。

2015-05-14)