Notch1、Notch2、 Notch3跨膜受體蛋白在淋巴瘤組織中的表達及意義

邢鴻雁++++++滕清良

[摘要] 目的 探討不同類型淋巴瘤組織中Notch1、Notch2、 Notch3跨膜受體蛋白的表達規律。 方法 通過免疫組織化學SP技術，觀察59例淋巴瘤組織和21例淋巴結反應性增生組織中Notch的表達水平。 結果 Notch1在T細胞淋巴瘤組和NK/T細胞淋巴瘤組表達的陽性率顯著高于B細胞淋巴瘤組及對照組，差異有統計學意義（P<0.01）。B細胞淋巴瘤組和NK/T細胞淋巴瘤組Notch2表達的陽性率明顯高于T細胞淋巴瘤組和對照組，差異有統計學意義（P<0.01）。NK/T細胞淋巴瘤組Notch3表達的陽性率明顯高于其他三組，差異有統計學意義（P<0.01）。結論 Notch信號通路的異常活化與淋巴瘤的發生、發展密切相關。其中NK/T細胞淋巴瘤的發生、發展可能與Notch1、Notch2、Notch3的高表達有關；Notch1的高表達可能在T細胞淋巴瘤的發生、發展中起到重要作用；B細胞淋巴瘤的發生、發展與Notch2的高表達相關。

[關鍵詞] Notch；淋巴瘤

[中圖分類號] R733.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）12-0005-04

The expression and its significance of Notch1-3 protein in lymphoma

XING Hongyan1，2 TENG Qingliang3

1.Qingdao University Medical College，Qingdao 266000，China； 2.Taishan Nursing Occupation College，Tai`an 271000，China； 3.Department of Hematology，the Central Hospital of Tai'an City in Shandong Province，Tai'an 271000，China

[Abstract] Objective To explore the expression and its significance of Notch1、Notch2、 Notch3 transmembrane receptor protein in different types of lymphoma tissues. Methods By employing immunohistochenistry SP staining，the expressions of Notch in 59 lymphomas were detected， and 21 cases of lymph-node reactive hyperplasia served as control group. Results The expression of Notch1 was significantly higher in T-cell lymphoma and NK/T-cell lymphoma than that in the B-cell lymphoma and the control group， the difference was statistically significant（P<0.01）. The expression of Notch2 was obviously higher in B-cell lymphoma and NK/T-cell lymphoma than that in the T-cell lymphoma and the control group，the difference was statistically significant（P<0.01）. The expression of Notch3 in NK/T-cell lymphoma group was significantly higher than that in the other three groups， the difference was statistically significant（P<0.01）. Conclusion Abnormal activation of Notch signaling pathway is closely related to the occurrence and development of lymphoma. The occurrence and development of NK/T-cell lymphoma is probably associated with the high expression of Notch1， Notch2 and Notch3； The occurrence and development of T- cell lymphoma is probably related to the high expression of Notch1； The occurrence and development of B-cell lymphoma is probably associated with the high expression of Notch2.

[Key words] Notch；Lymphoma

非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）是一組異質性很強的血液系統惡性腫瘤。目前，在世界范圍內淋巴瘤已成為發病率增長最快的血液系統惡性腫瘤，在血液系統惡性腫瘤的排名中僅次于白血病，嚴重威脅患者生命健康。雖然治療手段，如化療、放療相結合、生物治療、靶向治療、骨髓或造血干細胞移植等的綜合運用不斷提高，在一定程度上提高了治愈率及生存率，但仍有很大部分惡性淋巴瘤復發，其因腫瘤導致的死亡率排名第十位[1]。

因此深入探討淋巴瘤的發病機制，尋找新的治療靶點已成為研究熱點。很多研究發現Notch信號通路不僅在多器官及細胞的正常發育中發揮重要作用，其異常表達亦與一系列腫瘤的發生、發展密切相關，本研究主要檢測Notch1～3受體蛋白在淋巴瘤組織中的表達，進而發現規律，探討其在淋巴瘤發病中的作用。

1 材料與方法

1.1 標本及來源

收集泰安市中心醫院2008年8月～2014年8月的新發非霍奇金淋巴瘤的病理組織標本共59例，所有組織經泰安市中心醫院病理科專家劃分組織學類型，提出病理診斷。其中B細胞淋巴瘤39例（彌漫大B細胞淋巴瘤23例，濾泡性淋巴瘤5例，小淋巴細胞淋巴瘤5例，黏膜相關淋巴組織結外邊緣區B細胞淋巴瘤6例），T細胞淋巴瘤12例（包括血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤2例，間變性大細胞淋巴瘤3例，外周T細胞淋巴瘤7例），NK/T細胞淋巴瘤（鼻型）8例。59例患者中男33例，女26例；中位年齡54.35歲（最小6歲，最大82歲）。同時收集21例淋巴結反應性增生的組織標本作為對照組。所有病例均為初發，未經任何抗腫瘤治療及免疫治療等。

1.2主要試劑

跨膜受體蛋白Notch1抗體、跨膜受體蛋白Notch2抗體、跨膜受體蛋白Notch3抗體均購自上海安研商貿有限公司，SP免疫組化檢測試劑盒及濃縮型DAB染色試劑盒均購自福州邁新生物公司。

1.3方法

所有組織標本經4%甲醛溶液固定送病理科進行脫水、石蠟包埋、切片，然后采用免疫組織化學SP染色法進行染色。首先，切片置于60℃烘箱中烘烤過夜后經二甲苯脫蠟和梯度酒精（濃度遞減）水化，經PBS沖洗后將切片再浸入枸櫞酸緩沖液進行高溫抗原修復，PBS沖洗；將3%H2O2溶液滴到切片上，室溫避光孵育20 min，用以滅活內源性過氧化物酶；向組織切片滴加正常非免疫動物血清進行抗原封閉；滴加一抗（100倍稀釋），4℃過夜，復溫后滴加二抗、三抗，再滴加DAB顯色液；蘇木精復染后，經1%鹽酸酒精分化，梯度酒精（濃度遞增）脫水，二甲苯透明，干燥后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結果。用已知陽性標本作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果判定

Notch1～3受體蛋白細胞染色判斷標準參考文獻[2]，染色隨機取5個高倍（×400）視野，觀察染色陽性細胞百分數及染色程度。染色細胞數占細胞總數的百分數：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分。染色強度：未著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，深棕黃色及棕褐色為3分。染色細胞占細胞總數的百分數乘以染色強度，通過得分判斷結果，0分和1分視為陰性，2分以上為陽性。

1.5統計學分析

采用SPSS19.0統計學軟件進行數據處理。4×2表整體進行Fisher精確檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。不同病理類型間Notch1、Notch2、Notch3蛋白陽性率的兩兩比較采用χ2檢驗和Fisher確切概率法，用Bonferroni法對檢驗水準進行校正，校正值為0.008。

2 結果

2.1 Notch受體蛋白在不同類型淋巴瘤及淋巴結反應性增生組織中的表達水平

見表1。Notch受體蛋白免疫組化染色部分主要集中在細胞膜，部分散在分布于胞漿、胞核中，陽性細胞散在分布于視野中。

表1 Notch受體蛋白在病理組織中的表達水平

注：*表示差異有統計學意義

2.2 Notch受體蛋白陽性表達率與淋巴瘤病理類型的相關性分析

Notch1受體蛋白陽性表達率與淋巴瘤病理類型的相關性分析，見表2。Notch1蛋白在T細胞淋巴瘤組、NK/T細胞淋巴瘤組、B細胞淋巴瘤組及對照組的陽性率，分別為83.33%（10/12）、75.00%（6/8）、17.95%（7/39）和9.52%（2/21），T細胞淋巴瘤組、NK/T細胞淋巴瘤組Notch1受體蛋白的表達陽性率明顯高于B細胞淋巴瘤組和對照組，差異有統計學意義（P<0.01）。T細胞淋巴瘤和NK/T細胞淋巴瘤Notch1蛋白表達的陽性率比較差異無統計學意義（P>0.05）；B細胞淋巴瘤組和對照組的Notch1蛋白表達水平比較差異無統計學意義（P>0.05）。

表2 Notch1蛋白在不同病理類型中陽性率的兩兩比較

注：#表示連續性校正χ2值，*表示差異有統計學意義

2.3 Notch2蛋白在不同病理類型中陽性率的兩兩比較

Notch2受體蛋白陽性表達率與淋巴瘤病理類型的相關性分析，見表3。Notch2蛋白在T細胞淋巴瘤組、NK/T細胞淋巴瘤組、B細胞淋巴瘤組及對照組的陽性率分別為8.33%（1/12）、62.50%（5/8）、58.97%（23/39）和4.76%（1/21），B細胞淋巴瘤組和NK/T細胞淋巴瘤組Notch2受體蛋白陽性率明顯高于T細胞淋巴瘤組和對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。NK/T細胞淋巴瘤組與B細胞淋巴瘤組Notch2蛋白表達的陽性率比較差異無統計學意義（P>0.05）。T細胞淋巴瘤組與對照組的Notch2蛋白表達水平比較差異無統計學意義（P>0.05）。

表3 Notch2蛋白在不同病理類型中陽性率的兩兩比較

注：#表示連續性校正χ2值，*表示差異有統計學意義

2.4 Notch3蛋白在不同病理類型中陽性率的兩兩比較

Notch3受體蛋白陽性表達率與淋巴瘤病理類型的相關性分析，見表4。Notch3蛋白在T細胞淋巴瘤組、NK/T細胞淋巴瘤組、B細胞淋巴瘤組和對照組的陽性率分別為16.67%（2/12）、62.50%（5/8）、5.13%（2/39）和4.76%（1/21），NK/T細胞淋巴瘤Notch3蛋白表達的陽性率明顯高于T細胞淋巴瘤組、B細胞淋巴瘤組和對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。T細胞淋巴瘤組、B細胞淋巴瘤組和對照組的Notch3蛋白表達水平比較差異無統計學意義（P>0.05）。

表4 Notch3蛋白在不同病理類型中陽性率的兩兩比較

注：#表示連續性校正χ2值，*表示差異有統計學意義

3 討論

Notch信號通路由Notch受體、Notch配體、細胞內效應器分子（CSL-DNA結合蛋白）、下游靶基因及其他效應物等構成。Notch受體是一類結構高度保守的Ⅰ型單鏈跨膜蛋白，人的Notch受體家族包括Notch1～4。Notch受體包括胞外區、跨膜區和胞內區三部分。Notch信號通路被發現已有近百年，大量研究提示其不但涉及所有細胞的增殖、分化、凋亡等活動，而且Notch信號通路的異常活化在腫瘤發生發展過程中起著重要作用[3，4] 。本研究旨在觀察Notch1、2、3受體蛋白在不同類型淋巴瘤組織中的表達情況，了解其與淋巴瘤發生的相關性，為進一步研究提供依據。

Notch1在T淋巴細胞腫瘤的研究中發現，約50%的急性T淋巴細胞白血病（T-ALL）病例存在Notch1基因點突變或染色體易位，引起Notch1信號的異常活化，是導致T-ALL的原因之一[5，6]。這與本研究結果相似，Notch1在T細胞淋巴瘤和NK/T細胞淋巴瘤中的表達明顯高于B細胞淋巴瘤和對照組，提示Notch1在不同類型淋巴瘤發生中的作用可能不同，T細胞淋巴瘤和NK/T細胞淋巴瘤的發生可能與Notch1信號通路的異常活化有關。

Notch信號通路在B細胞淋巴瘤發病中所發揮的作用仍存在爭議，出現了致瘤和抑瘤兩種相反報道。本研究結果顯示Notch1、3受體蛋白在B細胞淋巴瘤中的表達與對照組沒有明顯差異，但Notch2受體蛋白的表達明顯高于T細胞淋巴瘤組和對照組，提示B細胞淋巴瘤的發生可能與Notch2受體蛋白表達升高有關。以往研究報道，Burkitt淋巴瘤Raji細胞、套細胞淋巴瘤Maver和Z138細胞可表達Notch1、Notch2，Raji細胞同時表達Notch下游靶基因Hes1[7]；有研究發現約8%彌漫大B細胞淋巴瘤和5%邊緣區淋巴瘤組織標本中可檢測到Notch2的突變[8，9]，提示Notch2突變可能參與了 B細胞淋巴瘤的發生、發展。相反，Zweidler-McKay PA[10]等研究發現，Notch2 的持續活化可抑制B細胞惡性腫瘤的生長，激活 Notch/Hes1信號可能成為治療B細胞惡性腫瘤的一種新方法。但相關研究數量有限，還需繼續深入研究，累計資料以明確Notch信號通路對B細胞淋巴瘤的作用。

Notch信號通路在NK/T細胞淋巴瘤發病中的作用研究較少，本研究顯示，Notch1、2、3在NK/T細胞淋巴瘤中的表達均明顯高于對照組，提示NK/T細胞淋巴瘤的發生可能與Notch信號通路的異常活化有關，與胡彥偉[11]等的研究結果有相似之處。但由于總體樣本量小，可能存在抽樣誤差，還需進一步深入研究。

綜上所述，本實驗研究了Notch1～3受體蛋白在不同類型淋巴瘤組織中的表達情況，提示不同Notch受體蛋白的高表達可能與淋巴瘤的發生、發展密切相關，但在不同類型淋巴瘤發病中所起的作用可能不盡相同。因此，活化或阻斷Notch信號通路可能成為治療不同類型淋巴瘤的新方法。如王艷芳等[7]研究發現γ-分泌酶抑制劑DAPT通過抑制Notch受體信號通路，對Jurkat細胞和Raji細胞的增殖有明顯的抑制及誘導凋亡作用，可以將細胞周期阻滯在G1期，并抑制Notch 通路的下游靶基因Hes1的表達，但對Maver和Z138細胞的作用較弱。Maria 等[12]使用DAPT作用于外周T 細胞淋巴瘤細胞，發現可降低Notch1 表達量并可引起腫瘤細胞的凋亡。另外，shRNA 靶向沉默Notch1 基因表達可以誘導套細胞淋巴瘤Jeko-1 細胞的凋亡[13]。上述研究均為探討淋巴瘤的發病機制及靶向治療措施提供了依據和參考，并為進一步的研究指明了方向。

[參考文獻]

[1] 趙平，陳萬青，孔靈芝，等. 中國癌癥發病與死亡2003-2007[M]. 北京：軍事醫學科學出版社，2012：148-159.

[2] Li M，Chen F，Clifton N，et al. Combined inhibition of Notch signaling and BCL-2/BCL-XL results in synergistic antmyeloma effect[J]. Mol Cancer Ther，2010，9（12）：3200-3209.

[3] Fidza UM，Arias AM. Cell and molecular biology of Notch[J].J Endocrinol，2007，194（3）：459-474.

[4] Cristofaro B，Emanueli C. Possible novel targets for therapeutic angiogenesis[J]. Curr Opin Pharmacol，2009，9（2）：102-108.

[5] Demarest RM，Dahmane N，Capobianco AJ. Notch is oncogenic dominant in T-cell acute lymphoblastic leukemia[J].Blood，2011，117（10）：2749-2750.

[6] Ferrando AA. The role of NOTCH 1 signaling in T-ALL[J].Hematology Am Soc Hematol Educ Program，2009：353-361.

[7] 王艷芳，李艷瑩，王晶，等. Notch信號分子在人淋巴瘤細胞中的表達及意義[J]. 中國實驗血液學雜志，2012， 20（1）：83-87.

[8] Lee SY，Kumano K，Nakazaki K，et al. Gain-of-function mutations and copy number increases of Notch2 in diffuse large B-cell lymphoma[J]. Cancer Sci，2009，100（5）：920-926.

[9] Troen G，Wlodarska I，Warsame A，et al. NOTCH2 mutations in marginal zone lymphoma[J]. Haematologica'，2008， 93（7）：1107-1109.

[10] Zweidler-McKay PA，He Y，Xu L，et al. Notch signaling is a potent inducer of growth arrest and apoptosis in a wide range of B cell malignancies[J]. Blood，2005，106（12）：3898-3906.

[11] 胡彥偉，張明智，曹玲. Notch信號分子在人NK細胞淋巴瘤細胞中的表達及其意義[J]. 吉林大學學報（醫學版），2013，39（4）：657-660.

[12] Maria RK，Lise MR，Edyta B，et al. Notch1 as a potential therapeutic target in cutaneous T-cell Lymphoma[J]. Blood，2010，116（14）：2504-2512.

[13] 黃軼群，黃曉璐，馬旭東. shRNA干擾NOTCH1基因對套細胞淋巴瘤Akt/mTOR信號通路的影響[J]. 中國實驗血液學雜志，2014，22（6）：1616-1620.

（收稿日期：2015-02-14）