擬南芥DNA甲基化及去甲基化研究進展

卓婉清　臘紅桂

摘 要 DNA甲基化及去甲基化是表觀遺傳的重要標志，廣泛存在于細菌、動物、植物中，在控制轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄沉默、調(diào)控基因表達（X染色體失活，基因印跡，副突變）、維持植物發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用。DNA表觀修飾不改變基因序列，僅改變堿基修飾，并通過有絲分裂或者無絲分裂在后代中遺傳。DNA甲基化是在甲基轉(zhuǎn)移酶作用下，以S腺苷甲硫氨酸為甲基供體，使DNA胞嘧啶發(fā)生甲基化。研究發(fā)現(xiàn)，DNA去甲基化普遍存在于生物體內(nèi)，在植物中，DNA糖基化酶介導(dǎo)的堿基切除修復(fù)機制被發(fā)現(xiàn)。基于此，對模式植物擬南芥中存在的DNA甲基化及去甲基化機制進行綜述。

關(guān)鍵詞 DNA甲基化；DNA去甲基化；表觀遺傳學(xué)

中圖分類號：Q943 文獻標志碼：A 文章編號：1673-890X（2015）09-129-05

表觀遺傳學(xué)（Epigenetics）的詞根最早出現(xiàn)于2000多a前，亞里士多德提出后生理論（The Theory of Epigenesis）。直到1975年，Holiday.R對表觀遺傳學(xué)進行了較為準確的解釋，他認為，表觀遺傳學(xué)不僅在發(fā)育過程，而且應(yīng)該在成體階段研究可遺傳的基因表達改變[1]。經(jīng)典遺傳學(xué)認為，核酸是遺傳的分子基礎(chǔ)，生命的遺傳信息都是由核酸序列決定的。然而隨著現(xiàn)代分子遺傳學(xué)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)，不僅DNA序列包含遺傳信息，核苷酸、組蛋白、染色質(zhì)水平的修飾也會造成基因表達模式的改變，并可以在后代中穩(wěn)定表達。

DNA甲基化是最常見的表觀遺傳現(xiàn)象，常見的DNA甲基化發(fā)生在DNA鏈上的胞嘧啶第五位碳原子和甲基間的共價結(jié)合，胞嘧啶被修飾為5甲基胞嘧啶（5mC）。與之相反，DNA去甲基化則是指5甲基胞嘧啶（5mC）被胞嘧啶取代的過程。

1 擬南芥DNA甲基化模式

在擬南芥中，DNA甲基化包括從頭開始甲基化及維持性甲基化。從頭開始甲基化是指DNA兩條鏈都沒有甲基化，通過甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）先使其中一條鏈甲基化，然后再使另一條鏈甲基化。維持性甲基化指DNA中已有一條鏈發(fā)生了甲基化，在DNA復(fù)制過程中通過甲基轉(zhuǎn)移酶來維持甲基化狀態(tài)[2]。DNA甲基化主要發(fā)生在對稱的CG，CHG序列和不對稱CHH序列（H代表A，G，C，T）。其中CG甲基化的維持由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶MET1（ DNMT1-like enzyme ）調(diào)控，CHG由CMT3植物特異甲基轉(zhuǎn)移酶來維持[3，4]，通過與KYP（H3K9me2甲基化轉(zhuǎn)移酶）形成回路，維持CHG甲基化[5]。不對稱的CHH甲基化在復(fù)制過程中不能保持，由RdDM（RNA介導(dǎo)的DNA甲基化）通道的甲基轉(zhuǎn)移酶DRM1和DRM2 發(fā)揮作用而形成[6]。新的研究發(fā)現(xiàn)，在met1和cmt3缺失突變體中，CHH基因組水平甲基化有更大的影響，相較于drm1和drm2突變體，這說明CMT3和MET1對于CHH甲基化可能有一定作用。此外維持CG，CHG甲基化可能也需要DRM1和DRM2作用[7]。擬南芥甲基化位點中，1/3位點與siRNAs 相關(guān)[8]，剩下2/3位點獨立于siRNAs。甲基轉(zhuǎn)移酶可以靶向依賴siRNA（siRNA-dependent）通道和不依賴siRNA （siRNA-independent）通道實現(xiàn)CG或者非CG甲基化。

1.1 MET1介導(dǎo)的CG甲基化

MET1具有與哺乳動物DNMTs相同的結(jié)構(gòu)域，在DNA復(fù)制過程中，發(fā)揮DNA甲基轉(zhuǎn)移酶作用維持植物CG甲基化。此外，met1突變體表現(xiàn)出明顯的花期延遲現(xiàn)象[9]，且通過全基因組甲基化分析發(fā)現(xiàn)其對于非CG甲基化水平也有一定影響。

1.2 CMT3介導(dǎo)的CHG甲基化

CMT家族含有染色質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域編碼植物特異甲基轉(zhuǎn)移酶，具有3個成員——CMT1、CMT2和CMT3，主要參與維持CHG甲基化。擬南芥中，通過對CMT3及KYP組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶進行結(jié)構(gòu)分析，揭示CMT3與KYP形成協(xié)同反饋回路共同維持CHG甲基化及TE轉(zhuǎn)座子沉寂[10]。KYP被招募到CHG甲基化位點通過SET和SRA結(jié)構(gòu)域；同時，CMT3的BAH結(jié)構(gòu)域識別H3K9me2甲基化位點，招募CMT3形成CHG甲基化[11，12]。

1.3 RdDM介導(dǎo)的CHH甲基化

在擬南芥中，24個核苷酸大小的小干擾RNA （24-nt siRNAs）和長鏈非編碼RNA指導(dǎo)的重新開始DNA甲基化及轉(zhuǎn)錄沉寂過程即為RNA指導(dǎo)的DNA甲基化（RdDM）。RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄基因沉寂是一個保守的現(xiàn)象，在真菌、植物、動物中都會發(fā)生。對于許多細胞內(nèi)功能如轉(zhuǎn)座子沉寂，基因組穩(wěn)定性，細胞保持等功能維持具有一定作用[13，14]。RdDM模型目前認為：RNA聚合酶Pol IV 產(chǎn)生單鏈RNAs 作為siRNAs前體，Pol IV與RNA依賴的RNA聚合酶II（RDR2）緊密聯(lián)系，RDR2對Pol IV的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加工成雙鏈RNA，這個過程借助ATP依賴的染色質(zhì)重塑因子CLSY1 作用。dsRNAs 被DCL3酶切成 24-nt siRNAs小片段，通過HEN1作用使siRNAs甲基化。單鏈siRNAs與AGO4或者AGO6[15]形成RdDM 效應(yīng)因子復(fù)合物。AGO4復(fù)合物結(jié)合于RNA聚合酶Pol V ；同時，Pol V轉(zhuǎn)錄需要蛋白復(fù)合物DDR（包括DRD1、DMS3、RDM1）。其中，DRD1 是ATP依賴的染色質(zhì)調(diào)控因子，DMS3 是黏連蛋白類似物， RDM1 具有單鏈DNA結(jié)合活性。RDM1是RdDM 效應(yīng)因子復(fù)合物的一部分，既與AGO4 相聯(lián)系又與重新開始的甲基轉(zhuǎn)移酶DRM2 一起催化CG， CHG和CHH甲基化的形成。Pol V轉(zhuǎn)錄物的進一步擴增需要一些RNA結(jié)合蛋白，其中SPT5L/KTF1被招募到Pol V 轉(zhuǎn)錄獨立于AGO4因子，起著穩(wěn)定效應(yīng)因子復(fù)合物作用[16]。IDN蛋白復(fù)合物也結(jié)合于 Pol V 轉(zhuǎn)錄物招募 SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物，一起參與異染色質(zhì)形成。而最近又發(fā)現(xiàn)，DTF1識別組蛋白H3K9甲基化，與CLSY1 相互作用在RdDM途徑上游發(fā)揮作用[17]。

2 擬南芥DNA去甲基化模式

DNA去甲基化包括被動去甲基化和主動去甲基化。被動去甲化發(fā)生在DNA復(fù)制過程中，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶不活躍，導(dǎo)致未被甲基化的位點保留在新合成的鏈中。而活躍的去甲基化獨立于DNA復(fù)制，存在5種可能的機制DNA糖基化酶初始的堿基切除修復(fù)機制、脫氨基作用及G/T堿基錯配修復(fù)機制、核酸切除修復(fù)機制、氧化去甲基化機制及水解去甲基化[18]。在擬南芥中研究進展主要集中于DNA糖基化酶初始的堿基切除修復(fù)及氧化去甲基化兩個機制上。其中，DNA糖基化酶家族中最先發(fā)現(xiàn)ROS1基因，之后DML2 和DML3等與ROS1功能類似的基因被發(fā)現(xiàn)，也發(fā)揮著去甲基化作用。目前認為 ROS1雙官能團酶切除甲基，切割碳鏈暴露缺口，產(chǎn)生脫堿基位點，ZDP和APE1L將3'磷酸變成3'羥基，最后通過DNA聚合酶和DNA連接酶進行缺口修復(fù)，使甲基化位點脫甲基化[18-20]。ROS1是該通道中發(fā)揮作用的主要功能蛋白[19]，那么ROS1是怎么靶向特異的位點？最近研究表明，甲基結(jié)合蛋白MBD7特異結(jié)合于高度甲基化的CG位點，并通過與IDM2和IDM3的相互作用，招募組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶IDM1催化H3K18和H3K23的乙?；痆21，22]，進而招募去甲基化酶ROS1和其他去甲基化酶來限制DNA甲基化的延伸，防止基因沉默。氧化去甲基化機制揭示JmjC 蛋白對組蛋白H3K9和H3K36甲基化進行氧化去甲基化。在擬南芥中，JmjC 組蛋白去甲基化酶相關(guān)蛋白家族的成員 IBM1被發(fā)現(xiàn)，使組蛋白H3K9去甲基化，阻止DNA中BNS（BONSAI ——位點高度甲基化[23，24] ，研究還發(fā)現(xiàn)負責(zé)可變剪切的EDM2等蛋白[25]通過調(diào)節(jié)H3K9去甲基化酶IBM1的表達參與DNA去甲基化。

3 擬南芥DNA去甲基化相關(guān)的酶

3.1 ROS1（Repressor Of Silencing 1）

ROS1基因編碼DNA去甲基化酶，是一個雙官能團蛋白，既糖基化DNA又發(fā)揮裂解酶作用裂解DNA，對于維持轉(zhuǎn)基因及同源內(nèi)源基因的表達非常重要。ROS1通過抑制啟動子甲基化來抑制RD29A-LUC轉(zhuǎn)基因沉寂及內(nèi)源基因沉寂[19]。在ROS1活性缺失的情況下，RdDM介導(dǎo)特異位點高度甲基化并使轉(zhuǎn)錄沉寂。

3.2 IDM1（Increased DNA Methylation 1）

IDM1，擬南芥DNA去甲基化的調(diào)控因子，對于防止ROS1調(diào)控的同源多拷貝基因及重復(fù)序列基因的高度甲基化非常重要。通過亞硫酸鹽測序發(fā)現(xiàn)在idm1突變體中造成擬南芥基因組DNA甲基化升高的位點與ros1突變體產(chǎn)生的甲基化位點有較高的重合度，推測IDM1參與ROS1介導(dǎo)的去甲基化調(diào)控通路。 IDM1 結(jié)合于染色質(zhì)中缺乏組蛋白H3K4二甲基及三甲基位點，使組蛋白H3乙?；瘎?chuàng)造一個染色質(zhì)環(huán)境為后續(xù)ROS1發(fā)揮作用。IDM1 是一個組蛋白H3乙酰基轉(zhuǎn)移酶，具有三個結(jié)構(gòu)域。通過DNA甲基化識別MBD結(jié)構(gòu)域識別CG甲基化位點，植物同源PHD結(jié)構(gòu)域識別未被甲基化的組蛋白H3K4表觀遺傳特征，組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶HAT結(jié)構(gòu)域使組蛋白H3K18和H3K23乙?；痆26]。由于IDM1與ROS1不能共定位，推測一個未知的與ROS1相互作用的蛋白可能識別乙?；腍3K18 和H3K23 標志，招募ROS1靶向特異位點進行DNA去甲基化作用。

3.3 IDM2及IDM3（Increased DNA methylation 2 and Increased DNA methylation 3）

IDM2 屬于高度保守的ACD蛋白家族，ACD蛋白最早在動物中發(fā)現(xiàn)，在各種細胞內(nèi)進程及抵抗逆境病害等方面有著重要作用[27，28，29]，在植物當中大部分ACD蛋白屬于熱休克蛋白[30] （sHSPs）.大量研究表明ACD蛋白作為分子伴侶發(fā)揮作用[27] ，IDM2是一個編碼α-晶體結(jié)構(gòu)域的核定位點白其轉(zhuǎn)錄水平并不受熱激影響，與IDM1具有相互作用證明它可能作為分子伴侶與IDM1一起參與組蛋白H3K18 乙酰化，在DNA活躍去甲基化及阻止轉(zhuǎn)錄沉寂中發(fā)揮作用[31]。IDM3與IDM2類似，具有α-晶體結(jié)構(gòu)域且與MBD7具有相互作用[21]。

3.4 MBD7（Methyl-CpG-Binding Domain）

之前研究表明，DNA活躍去甲基化主要是由ROS1蛋白發(fā)揮主要作用，但是ROS1蛋白怎么靶向特異的甲基化位點并不清楚，而研究發(fā)現(xiàn)MBD7在特異識別甲基化位點發(fā)揮作用。MBD7蛋白的N端為甲基化識別結(jié)構(gòu)域特異性識別CG甲基化位點，C端有很強的染色質(zhì)識別能力。與IDM2及IDM3具有相互作用，進一步招募IDM1[26] 及其他一些蛋白進行組蛋白H3K18 和H3K23乙酰化，為ROS1發(fā)揮作用創(chuàng)造染色質(zhì)環(huán)境（圖1）。mbd7 突變體導(dǎo)致NPTII轉(zhuǎn)基因沉寂 但不影響ProRD29A：LUC轉(zhuǎn)基因沉寂，全基因組甲基化位點分析mbd7突變體甲基化位點與ros1突變體造成的甲基化位點有部分重合，推測MBD7可能是ROS1調(diào)控通道中的蛋白[22]，且MBD7靶向靠近染色體中心高密度DNA甲基化位點， 同時影響Gypsy類型反轉(zhuǎn)座子活動。

3.5 ZDP（Zinc Finger DNA 3Phosphoesterase）

ZDP突變體導(dǎo)致DNA高度甲基化及報告基因轉(zhuǎn)錄沉寂，全基因組甲基化分析zdp突變體使上百個內(nèi)源基因位點高度甲基化，并且發(fā)現(xiàn)DNA磷酸化酶ZDP與ROS1具有相互作用，是ROS1活躍去甲基化分支的下游蛋白[32]。ROS1作用位點后產(chǎn)生單核苷酸缺口，ZDP將 3'磷酸變?yōu)?'羥基，通過單鏈核苷酸切除和長鏈DNA合成[33，34] ，使后續(xù)發(fā)生DNA聚合及連接反應(yīng)修復(fù)缺口，實現(xiàn)去甲基化過程。最近又發(fā)現(xiàn)ROS1作用后的位點并不繼續(xù)β，δ裂解而仍然是β裂解產(chǎn)物，產(chǎn)生3'不飽和醛基，不依賴于ZDP活動，可能通過AP 核酸內(nèi)切酶 （APEs）發(fā)揮作用。

3.6 APE1L（Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease）

APE1L，擬南芥AP核酸內(nèi)切酶的一種，與ROS1蛋白在體內(nèi)共定位。ROS1蛋白β裂解產(chǎn)生3'不飽和醛基，隨后APE1L將不飽和醛基轉(zhuǎn)換成3'羥基。生化數(shù)據(jù)表明APE1L有微弱的3'磷酸活性，證明APE1L屬于ROS1調(diào)控通道另一分支的DNA活躍去甲基化下游蛋白，獨立于ZDP分支通道（圖2）。通過對突變體ape1l全基因組高度甲基化檢測[20]。推測APE1L是一個多功能酶，可能與ZDP一起作用于DME糖基化酶調(diào)控通道，控制胚乳中印記基因及種子的生長。

3.7 IBM1（Increase in BONSAI Methylation 1）

IBM1是組蛋白H3K9me2去甲基化酶，在擬南芥中一方面，甲基轉(zhuǎn)移酶CMT3與組蛋白甲基化酶KYP產(chǎn)生CHG甲基化及組蛋白H3K9me2；另一方面，由存在的CG甲基化招募IBM1發(fā)揮去除KYP產(chǎn)生的H3K9me2作用（圖3）。IBM1調(diào)控的甲基化位點位于IBM1基因的一段很長且高度保守的內(nèi)含子上（BONSAI 位點），編碼兩種mRNA變體，長鏈變體（IBM1-L）和短鏈變體（IBM1-S）。IBM-L編碼有功能的IBM1蛋白包含jmjC 結(jié)構(gòu)域[24]，有實驗證明在met1突變體中由于CG甲基化缺失，短鏈變體（IBM1-S） 表達量不受影響，長鏈變體（IBM1-L） 的表達量下調(diào)，導(dǎo)致H3K9me2的聚集。同時，ROS1去甲基化酶的活性也受到影響[23，24]。因此，通過控制H3K9去甲基化酶及DNA去甲基化酶活性，形成自我調(diào)控的回路維持CG甲基化及組蛋白修飾。

3.8 EDM2（Enhanced Downy Mildew 2）

染色質(zhì)調(diào)控因子EDM2在阻止轉(zhuǎn)錄沉寂和DNA高度甲基化方面起作用，包含植物同源結(jié)構(gòu)域識別活躍的或者受抑制的組蛋白甲基化標志。EDM2通過促進mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生3'ployA末端來調(diào)控組蛋白H3K9去甲基化酶基因IBM1的表達，一起控制GHG甲基化和轉(zhuǎn)錄基因沉寂。edm2突變體與ibm1及DNA糖基化酶三突變體rdd重合上百個高度甲基化區(qū)域，其中包括與ROS1靶向區(qū)域[25]。研究認為類似于IDM1，EDM2和IBM1可能一起創(chuàng)造合適的染色質(zhì)環(huán)境以便后續(xù)ROS1發(fā)揮作用，同時還發(fā)現(xiàn)EDM2在一些轉(zhuǎn)座子的沉寂方面也有著一定的作用。

4 結(jié)語與展望

DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA調(diào)控、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑、RNA干擾、基因組印跡、基因沉默、X染色體不活躍等都屬于表觀遺傳學(xué)范疇。其中，DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)重要的標志之一，發(fā)展了各種方法檢測DNA甲基化水平。在擬南芥中主要應(yīng)用了甲基敏感酶進行核酸雜交（Southern blotting）及酶切PCR（CHOP PCR）檢測，單個位點重亞硫酸鹽測序（Bisulfite sequencing），染色質(zhì)免疫共沉淀序列分析（ChIP-seq），全基因組重亞硫酸鹽測序（Whole genome bisulfite sequencing）等，為進行相關(guān)研究提供了極大便利。目前，研究DNA甲基化對于控制轉(zhuǎn)座子活動、植物生長發(fā)育、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄基因表達、如X染色體不激活、基因印跡等方面起著重要的生物學(xué)作用。對于DNA甲基化機制的研究也逐漸趨于完善，但是對于DNA甲基化與其他表觀遺傳調(diào)控機制如組蛋白修飾，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)等方面的關(guān)系仍然不是很清楚，這將是今后研究的一個重點。

與DNA甲基化相反，DNA去甲基化在阻止轉(zhuǎn)錄基因沉寂，防止特異位點高度甲基化等方面發(fā)揮重要作用。目前，對于DNA去甲基化的研究上不夠完善，如ROS1糖基化酶的堿基切除修復(fù)機制的下游機制如何進行？是否存在其他獨立于ROS1的活躍去甲基化機制及其如何發(fā)揮作用等方面尚不清楚。

DNA甲基化的水平主要由甲基化和去甲基化這兩個途經(jīng)來協(xié)同調(diào)控。因此，有關(guān)DNA甲基化及去甲基化研究必將有力地促進表觀遺傳學(xué)的研究進程，進一步提高人們對于表觀遺傳學(xué)的認識，為其將來的應(yīng)用奠定堅實的基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：劉昀）