RRM1蛋白表達(dá)與體外藥敏實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌化療的價(jià)值

黃 娟 劉 浩 鄧 沖

·短篇論著·

RRM1蛋白表達(dá)與體外藥敏實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌化療的價(jià)值

黃 娟1劉 浩2鄧 沖3

肺癌，非小細(xì)胞； 核苷酸還原酶亞單位MI； 吉西他濱； 藥敏實(shí)驗(yàn)； 個(gè)體化治療

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是目前威脅人類健康與生命最大的惡性腫瘤之一。即使可切除的NSCLC患者5年生存率仍令人失望，改善術(shù)后NSCLC患者局部控制率及遠(yuǎn)期生存率一直是臨床關(guān)注的焦點(diǎn)，個(gè)體化化療是21世紀(jì)胸外科臨床發(fā)展的方向和理想治療模式[1]。本研究采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)40例NSCLC患者手術(shù)切除的新鮮組織標(biāo)本中核苷酸還原酶M1亞基(ribonucleotide reductase subunit M1, RRM1)蛋白表達(dá)水平，同時(shí)進(jìn)行體外原代培養(yǎng)，MTT藥敏試驗(yàn)，檢測(cè)臨床常用非小細(xì)胞肺癌一線化療藥物吉西他濱(Gemcitabine)的敏感性，比較分析RRM1表達(dá)與吉西他濱耐藥的相關(guān)性。旨在探討其在NSCLC個(gè)體化治療中療效的意義，為敏感藥物的選擇提供參考。

材料與方法

一、 實(shí)驗(yàn)材料

1. 肺癌細(xì)胞: 收集2012年3月至2013年9月我科NSCLC患者手術(shù)切除的新鮮組織標(biāo)本40例。患者年齡38～68歲，平均年齡53歲，其中，男29例，女11例，均為Ⅰ-ⅢA期，肺腺癌23例、肺鱗癌15例，大細(xì)胞癌2例。

2. 化療藥物: 吉西他濱規(guī)格為200 mg/支，產(chǎn)地江蘇豪森藥業(yè)，試驗(yàn)藥物濃度按文獻(xiàn)[1]配制，用無菌生理鹽水配成母液，按照實(shí)驗(yàn)藥物濃度的0.5倍、1.0倍、2倍的劑量進(jìn)行配制，保存于-20 ℃。

3. 主要試劑: RRM1多克隆抗體(美國PROTEINTECH公司)；免疫組化(SP)試劑盒(美國DACO公司)；DAB顯色試劑盒(美國DACO公司)；RPMI-1640(美國Gibco公司)；胰蛋白酶(美國Amresco公司)；淋巴細(xì)胞分離液：(天津市秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；小牛血清:(杭州四季青生物工程材料有限公司)；MTT(四甲基氮唑藍(lán)):(美國Amresco公司)；DMSO: 二甲基亞砜。

4. 實(shí)驗(yàn)儀器: 分析純(美國Sigma公司)；離心機(jī)(Anke TGL-16B, 上海安亭科學(xué)儀器廠)；超低溫冰箱(Revco Value Series, thermo fisher scientific LLC)；電子天平(AUY220, SHMADZU)；CO2培養(yǎng)箱(HARRIS-301T, HARRIS)；倒置光學(xué)顯微鏡(南京江南永新光學(xué)有限公司)；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar公司)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀((Freedom Evolyzer-2，TeCan)；電子恒溫三用水箱(達(dá)佳，廣東省汕頭市醫(yī)用設(shè)備廠有限公司)；蠕動(dòng)泵(MILLPORE公司)；微量振蕩器(MH-1型，江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司)

二、研究方法

1. MTT法吉西他濱體外藥敏檢測(cè): 單細(xì)胞懸液按文獻(xiàn)[1]制備，取手術(shù)切除的新鮮癌組織約1.0 cm3大小，選取無壞死部分，立即浸入無菌培養(yǎng)瓶中，10 min內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。在超凈臺(tái)上，用無菌PBS液沖洗2次，切除組織包膜，結(jié)締組織與壞死組織，剪成盡可能小的組織碎塊，大小約1 mm3。將組織小塊置于0.25%胰酶40 ml中，裝入培養(yǎng)瓶，置于37 ℃水浴箱中30 min，并不時(shí)搖動(dòng)，使其充分消化，期間在鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞變圓接近脫壁時(shí)，棄消化液，用10 ml完全-1640終止消化。用200目篩網(wǎng)將消化后的細(xì)胞懸液過濾收集，用無菌PBS液洗滌2次(離心半徑 8 cm，1500 r/min，離心 20 min)，懸于20 ml完全-1640中，鏡下觀察細(xì)胞。于無菌離心管中依次輕輕加入100%及60%的淋巴細(xì)胞分離液各10 ml，其上再沿管壁輕輕加入細(xì)胞懸液(離心半徑 8 cm，2000 r/min，離心20 min)，收集60%分離液界面上的細(xì)胞，加5倍無菌PBS液(離心半徑 8 cm，2000 r/min，離心20 min)，去上清，加15ml無菌PBS液，離心前進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，再次離心，(離心半徑 8 cm 2000 r/min，離心20 min)去上清，調(diào)整細(xì)胞濃度為(1×105～2×105/ml)。種96孔板，分別設(shè)加藥孔，陰性對(duì)照孔，空白孔，并設(shè)3復(fù)孔。在7 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加藥孔加入吉西他濱，陰性對(duì)照孔與空白孔均加完全-1640，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，MTT法進(jìn)行藥敏檢測(cè)，參照《細(xì)胞培養(yǎng)》[2]計(jì)算活性抑制率，當(dāng)加藥組血漿高峰濃度水平時(shí)的抑制率大于50%時(shí),即為高敏，小于30%為耐藥，介于2者之間為中敏。

2. SP法RRM1蛋白表達(dá)水平檢測(cè): 手術(shù)切除的新鮮組織標(biāo)本40例，用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(SP 法)進(jìn)行免疫組化檢測(cè)其RRM1蛋白，實(shí)驗(yàn)步驟按SP試劑盒說明書進(jìn)行。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，組間比較用四格表的確切概率法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

40例新鮮組織標(biāo)本體外藥敏實(shí)驗(yàn)對(duì)吉西他濱敏感者22例，耐藥18例。40例石蠟包埋標(biāo)本RRM1高表達(dá)17例，低表達(dá)23例。17例RRM1高表達(dá)組，對(duì)吉西他濱敏感7例，敏感率41.2%，而23例RRM1低表達(dá)組，對(duì)吉西他濱敏感17例，敏感率73.9%，見表1。對(duì)同時(shí)滿足RRM1低表達(dá)組中MTT藥敏提示對(duì)吉西他濱敏感者選用GP(順鉑+吉西它濱)方案化療4個(gè)療程，其余選用可接受的二線方案(順鉑+多西他賽)化療4個(gè)療程。對(duì)照組40例以國際公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)方案或經(jīng)驗(yàn)用藥為主，包括順鉑+長春瑞濱，順鉑+紫杉醇，順鉑+長春花堿，順鉑+吉西它濱，順鉑+多西他賽等化療方案。隨訪6個(gè)月～2年，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組完全緩解(CR)+部分緩解(PR)即有效率分別為44.5%和42.4%、疾病穩(wěn)定(SD)分別為32.5%和28.1%、疾病進(jìn)展(PD)分別為25.3%和28.5%，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而中位生存時(shí)間(MST)分別為19.3個(gè)月和14.8個(gè)月(P<0.05),中位無進(jìn)展生存(PFS)為6.7個(gè)月和6.5個(gè)月(P>0.05)，見表2。

表1 RRM1蛋白表達(dá)與吉西他濱體外藥敏實(shí)驗(yàn)的相關(guān)性

表2 兩組化療效果比較

注：CR：完全緩解；PR：部分緩解；SD：疾病穩(wěn)定；PD：部分緩解；MST：中位生存時(shí)間；PFS：中位無進(jìn)展生存

討 論

肺癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，惡性程度很高，其發(fā)病率及病死率均居首位[2]。其中80%的肺癌是NSCLC，手術(shù)已成為早期NSCLC的標(biāo)準(zhǔn)治療。但約1/3甚至近1/2的NSCLC就診時(shí)已屬晚期，可手術(shù)切除的患者5年生存率僅為30%～40%[3]，故化療在術(shù)后局部控制及提高遠(yuǎn)期生存方面起著重要作用。但選擇對(duì)NSCLC有效的化療藥物，一直是臨床腫瘤化療關(guān)注的問題。

針對(duì)NSCLC術(shù)后化療藥物的選擇，國內(nèi)外多采用耐藥蛋白的測(cè)定，藥敏實(shí)驗(yàn)或經(jīng)驗(yàn)用藥等提高療效，但術(shù)后10%～15%的患者經(jīng)歷復(fù)發(fā)，15%～60%的患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4]。究其原因，NSCLC不同患者對(duì)同一種化療藥物敏感性可能不同，并與肺癌細(xì)胞的生物學(xué)特性、患者個(gè)體差異、化療藥物的毒性反應(yīng)等多因素相關(guān)。目前，各級(jí)醫(yī)院采用同一個(gè)化療方案治療不同的NSCLC患者，帶有一定的盲目性。患者因病理類型及個(gè)體差異的原因?qū)熕幬锏拿舾行杂休^大差異，因此越來越多的耐藥蛋白的檢測(cè)以及不同的體外藥敏試驗(yàn)方法應(yīng)用于臨床，作為選擇敏感化療方案，實(shí)行個(gè)體化治療的手段。

吉西他濱作為NSCLC化療的一線藥物，具有一定優(yōu)勢(shì)得到普遍認(rèn)可[5-6]。但耐藥的發(fā)生減弱了吉西他濱在NSCLC治療中的療效。RRM1是核苷酸還原酶(ribonucleotide reductase, RR)的一個(gè)亞單位，RR使核糖核酸轉(zhuǎn)變成的脫氧核苷酸是DNA合成和修復(fù)所必需的物質(zhì)。RRMl定位于染色體11ql5.5區(qū)域，以上特性決定了 RRMl可能與NSCSL患者的化療耐藥與預(yù)后相關(guān)[7-8]。Rosell等[9]研究認(rèn)為RRMl是吉西他濱的分子作用靶點(diǎn)，多項(xiàng)研究顯示吉西他濱耐藥與RRM1蛋白表達(dá)相關(guān)，但臨床治療NSCLC可選擇的藥物有很多種，進(jìn)行單一生物學(xué)標(biāo)志物RRM1的檢測(cè)其預(yù)測(cè)能力是不足的。故本實(shí)驗(yàn)加入了更精細(xì)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與體外藥敏試驗(yàn)技術(shù)相結(jié)合的方法進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，期望達(dá)到更精確的個(gè)體化治療[10-16]。

我們將80例患者隨機(jī)分為2組，患者均在自愿接受不同治療方案前簽署知情同意書，我們用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)40例NSCLC手術(shù)切除的新鮮組織標(biāo)本的核苷酸還原酶M1亞基(RRM1)蛋白表達(dá)水平，RRM1低表達(dá)23例，同時(shí)對(duì)新鮮腫瘤組織進(jìn)行體外原代培養(yǎng)，并作了MTT藥敏試驗(yàn)，其中17例對(duì)吉西他濱敏感，RRM1高表達(dá)17例，其中7例對(duì)吉西他濱敏感，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示RRM1低表達(dá)多數(shù)對(duì)吉西他濱敏感，RRM1高表達(dá)多數(shù)對(duì)吉西他濱耐藥，針對(duì)低表達(dá)組中對(duì)吉西他濱敏感的患者我們選用標(biāo)準(zhǔn)一線化療方案吉西他濱+順鉑，而其余患者選用二線方案多西他賽+順鉑。另外40例對(duì)照患者在經(jīng)驗(yàn)用藥方案下接受治療，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組有效率分為44.5%，對(duì)照組為42.4%、實(shí)驗(yàn)組SD為32.5%，對(duì)照組為28.1%、實(shí)驗(yàn)組PD為25.3%，對(duì)照組PD為28.5%，實(shí)驗(yàn)組PFS為6.7個(gè)月，對(duì)照組為6.5個(gè)月，4組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而實(shí)驗(yàn)組MST為19.3個(gè)月，對(duì)照組為14.8個(gè)月，P<0.05。表明將RRM1蛋白的表達(dá)與吉西他濱體外藥敏實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的治療方法可使患者獲得更長的生存期。

本研究結(jié)果顯示：將RRM1蛋白表達(dá)與吉西他濱體外藥敏實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，可作為NSCLC個(gè)體化治療的選擇之一。將該方法應(yīng)用于臨床，建立肺癌藥敏檢測(cè)系統(tǒng)，可使患者獲得更長的生存期，在肺癌的綜合治療中具有一定的臨床實(shí)用價(jià)值。本研究中涉及的免疫組化方法，肺癌細(xì)胞原代培養(yǎng)及MTT試驗(yàn)均為常見試驗(yàn)技術(shù)，該方法重復(fù)性好、操作簡便、利于推廣。

但本研究也有不足之處：試驗(yàn)病例較少，前述結(jié)論需在以后的病例收集中進(jìn)一步驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)組選用多西他賽+順鉑方案未做耐藥蛋白檢測(cè)及體外藥敏試驗(yàn)，部分患者也可能耐藥。該方法中的難點(diǎn)在于肺癌細(xì)胞的原代培養(yǎng)，尤其是滿足藥敏試驗(yàn)的肺癌細(xì)胞數(shù)是關(guān)鍵，若要推廣還需進(jìn)一步簡化試驗(yàn)流程，才能使該方法更加成熟。

1 劉 浩, 洪志鵬, 尹小川, 等. 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的原代培養(yǎng)及個(gè)體化藥敏實(shí)驗(yàn)研究[J/CD]. 中華肺部疾病雜志：電子版, 2011, 4(2): 94-97.

2 Alberg AJ, Ford JG, Samet JM, et al. Epidemiology of lung cancer:ACCP evidence-based clinical practice guidelines(2nd edition)[J]. Chest, 2007, 132(3 suppl): 29S-55S.

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(本文編輯：黃紅稷)

黃 娟，劉 浩，鄧 沖. RRM1蛋白表達(dá)與體外藥敏實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌化療的價(jià)值[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2015， 8(1)： 76-78.

·醫(yī)學(xué)動(dòng)態(tài)·

科學(xué)家最新發(fā)現(xiàn)：注射細(xì)菌殺滅癌細(xì)胞

近日，在好萊塢舉辦的年度臨床介入腫瘤學(xué)研討會(huì)上，來自Anderson癌癥研究中心的研究人員通過研究揭示了，利用細(xì)菌或許可以幫助治療癌癥。研究人員將一種名為諾維氏芽孢桿菌-NT(Clostridium novyi-NT)的細(xì)菌的孢子注射入6位病人機(jī)體的腫瘤中，隨后細(xì)菌就可以在腫瘤中生長并且殺滅癌細(xì)胞。

在將諾維氏芽孢桿菌-NT注射入癌癥病人機(jī)體之前，研究人員首先通過移除該細(xì)菌的危險(xiǎn)毒素來降低細(xì)菌的危險(xiǎn)性；研究結(jié)果顯示6位病人均存活下來了，但其中有一位病人在細(xì)菌注射后因一些非相關(guān)的原因發(fā)生了死亡。研究者Ravi Murthy表示，當(dāng)腫瘤生長達(dá)到一定尺寸后，其中一部分腫瘤組織就不再需要氧氣了，其就會(huì)對(duì)常規(guī)的癌癥療法產(chǎn)生耐受性，比如對(duì)放療和化療產(chǎn)生耐受等；而諾維氏芽孢桿菌-NT則可以在無氧狀態(tài)下生存從而在不影響正常組織的情況下破壞腫瘤細(xì)胞，同時(shí)該細(xì)菌也會(huì)誘發(fā)機(jī)體對(duì)癌癥產(chǎn)生免疫反應(yīng)。

從本質(zhì)上來講，諾維氏芽孢桿菌-NT在腫瘤組織中可以引發(fā)潛在的殺滅癌細(xì)胞的感染過程，本文研究對(duì)于后期開發(fā)新型的抗癌療法提供了新的研究思路和依據(jù)。

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.01.020

四川省瀘州市科技局基金資助(2012-177)

646000 四川，瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科1646000 四川，瀘州醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)醫(yī)院胸外科2、 中心實(shí)驗(yàn)室3

劉 浩， Email: liuhaoer@sina.com

R563，R734.2

B

2014-06-22)