低氧性肺動脈高壓小鼠肺的環狀RNA表達譜研究

夏世金 邰先桃 李 炳 蘇晉燕 狄 樺 劉露梅 萬文斌 胡明冬

·論著·

低氧性肺動脈高壓小鼠肺的環狀RNA表達譜研究

夏世金1邰先桃2李 炳3蘇晉燕2狄 樺2劉露梅1萬文斌4胡明冬5

目的采用環狀RNA(circRNA)芯片篩選低氧性肺動脈高壓(HPH)小鼠肺組織中差異表達的circRNA，分析circRNA表達譜特征，為HPH發生機制提供研究方法。方法20只健康雄性C57BL/6小鼠(體質量17～20 g)按數字表法隨機分為HPH模型組與常氧組，每組10只。HPH模型組小鼠置于自制常壓低氧艙內，艙內氧濃度(10±0.5)%O2。每天連續低氧處理8 h，連續21 d。常氧組小鼠置于常氧環境飼養。通過測定右心室收縮壓和右心肥大指數驗證HPH小鼠模型復制成功后，處死小鼠，取肺組織，用circRNA芯片檢測各組肺組織circRNA表達譜，并進行組間比較與分析，以明確差異表達的circRNAs。結果與常氧組比較，HPH模型組肺組織中表達顯著上調的circRNAs共有23個(P<0.01，P<0.05)；表達顯著下調的circRNAs共有41個(P<0.01，P<0.05)。結論circRNA芯片可用于篩選HPH差異表達的circRNA，circRNA可能參與HPH調控機制。

環狀RNA； 低氧性肺動脈高壓； 小鼠； 肺； 芯片； 非編碼RNA； 可變剪接； 微小RNA

低氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension, HPH)是高致死率和高致殘率的病理生理綜合征，被認為是“假惡性”腫瘤[1]，嚴重危害患者的生命。有關HPH機制理論可歸納為肺血管結構重建學說等，治療策略有降低肺動脈壓力等[2]。而目前尚沒有治療HPH的特效方法，歸因于HPH機制尚未完全闡明，甚至還沒有可靠的臨床生物學標志物，不能進行早期診斷與治療。經典遺傳學在研究HPH機制方面盡管取得一些進展，但遭遇困境，而近年盛行的表觀遺傳學將帶來希望，尤其是環狀RNA(circular RNA，circRNA)有可能為闡明HPH的機制、尋求早期干預靶點與確立可用于臨床早期診斷的生物學標志物等提供突破口。

circRNA是新近確認的一類特殊的非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)分子，是繼微小RNA(microRNA,miRNA)后RNA家族的一顆極具發展潛力的正在升起的新星，也是RNA領域最新的研究熱點。通過與疾病關聯的miRNA相互作用，circRNA在疾病的發生發展中發揮著重要的調控作用[3]。研究發現，小腦變性相關蛋白1反義轉錄物(antisense to the cerebellar degeneration-related protin 1 transcript, CDR1as)是一種circRNA，吸附miR-7，影響miR-7靶基因的活性[4-5]。CDR1as可能與帕金森病有關[6]。睪丸特異性基因Sry的circRNA可吸附miR-138，充當miR-138海綿[4]。circRNA cANRIL能影響動脈粥樣硬化的發生[7]。

那么，circRNA是否具有調控HPH發生的機制，目前尚不明確。因此 ，本試驗建立HPH小鼠模型，創新性使用circRNA芯片檢測HPH小鼠肺組織中circRNA表達，分析其特異表達的circRNA，研究其circRNA表達譜特征，為闡明HPH發生機制、干預靶標和早期生物學診斷標志物提供依據，具有重要的理論意義和應用價值。

材料與方法

一、主要試劑

TRIzol?試劑(Invitrogen life technologies)；氯仿、異丙醇(上海化學試劑有限公司)和100% 乙醇(上海化學試劑有限公司)；75% 乙醇 (以DEPC處理的水配制)；無RNA酶的水和無RNA酶的糖原(Invitrogen life technologies)；Arraystar Mouse circRNA Microarray(6×7 K，美國Arraystar公司)，包含1797個circRNAs。實驗由上海康成生物工程有限公司負責完成。

二、動物與實驗方法

1. 動物與分組：20只健康雄性C57BL/6小鼠(購自上海杰思捷動物有限公司)，體質量17～20 g，按隨機數字表法分為2組：HPH模型組與常氧組，每組10只。遵循實驗動物使用相關條例和取得實驗動物倫理委員會批準后進行本實驗，在復旦大學附屬金山醫院中心實驗室完成動物實驗。

2. HPH模型制備：HPH模型組小鼠置于常壓低氧艙內，控制艙內氧濃度在(10±0.5)%O2。每天連續低氧處理8 h，連續21 d。期間除更換墊料與添加食物飲水外，盡量不開啟艙門。常氧組小鼠置于常氧環境飼養。

3. 取材：通過測定右心室收縮壓和右心肥大指數驗證HPH小鼠模型復制成功后，處死小鼠，快速取出肺臟，生理鹽水沖去肺臟淤血，取肺組織，置于液氮備用。每組隨機取3只小鼠肺組織進行circRNA芯片實驗。

4. circRNA芯片實驗操作流程：①樣本RNA提取 ；②RNA 樣品質控：使用NanoDrop ND-1000評估RNA量和質量，RNA完整性通過標準變性凝膠電泳進行評估；③RNA標記：根據Arraystar Super RNA Labeling(Arraystar, Inc.)試劑盒操作步驟，每個樣本的總RNA采用隨機引物擴增、反轉錄為熒光標記的cRNA；④芯片雜交：熒光標記的cRNAs在Arraystar Mouse circRNA Array(6×7 K, Arraystar)上雜交，隨后在Agilent Hybridization Oven上65 ℃孵育17 h；⑤芯片掃描：洗片后，在 Axon GenePix 4000B掃描儀上掃描。

5. circRNA芯片數據采集與分析流程：①原始數據提取：芯片掃描圖片導入GenePix Pro 6.0 (Axon)軟件并讀值，得到原始數據；②circRNA表達譜：用R軟件包對數據進行歸一化及后續數據處理；③差異表達的circRNA：兩組樣本間差異表達的circRNA通過Fold Change和P-value進行篩選。P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

一、肺組織差異表達上調的circRNAs

常氧組比較，HPH模型組肺組織中表達顯著上調的且有統計學差異的circRNAs共有23個(P<0.01，P<0.05)，見表1。

表1 HPH模型組比常氧組表達顯著上調的circRNAs(n=3)

二、肺組織差異表達下調的circRNAs

與常氧組比較，HPH模型組小鼠肺組織中表達顯著下調的且有統計學差異的circRNAs共有41個(P<0.01，P<0.05)，見表2。

表2 HPH模型組比常氧組表達顯著下調的circRNAs(n=3)

討 論

circRNA是一類特殊的非編碼RNA分子，是RNA領域中一個最新的研究熱點。目前研究發現，circRNA有下列主要特征[3]：①circRNA由特殊的可變剪切產生，大量存在于真核細胞的細胞質[8]，但少部分內含子來源的circRNA則存在于細胞核內[9]；②具有一定的組織特異性、時序特異性和疾病特異性[8]；③廣泛存在于人體細胞中，有時甚至超過它們線性異構體的10倍之多[10-11]；④與傳統的線型RNA(linear RNA，含5′和3′末端)不同，circRNA分子呈封閉環狀結構，不被核酸外切酶RNase R降解，比線性RNA更穩定[11-13]；⑤具有高度保守性[10-11]，部分具有快速的進化性改變[9,14]；⑥大多數來源于外顯子，少部分由內含子直接環化形成[14]；⑦circRNA分子富含miRNA應答元件(miRNA response element, MRE)，可充當競爭性內源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)，與miRNA結合，吸附miRNA，在細胞中起到miRNA海綿(miRNA sponge)的作用，進而解除miRNA對其靶基因的抑制作用，上調靶基因的表達[4]；⑧大部分是ncRNA[10]。這些特征使得circRNA在研究疾病發生機制、干預靶點和生物學標志物等方面顯示顯著的優勢。

目前，circRNA的命名尚未統一。由于研究者各自的研究角度不同而造成命名的不一致[3]。因此，亟需構建一個更恰當的、適用的和公認的circRNA命名體系。本實驗采用circbase數據庫進行circRNA命名。

通過與疾病關聯的miRNA相互作用，circRNA在疾病中發揮著重要的調控作用，為闡明疾病的發生機制、干預靶點和新型的疾病臨床診斷標志物等提供強有力的手段。研究表明， CDR1as有至少60個與miR-7相結合的保守結合位點，從而充當miR-7海綿，有效影響miR-7靶基因活性[4-5]。CDR1as和miR-7在發育的中腦區域具有共同高表達的特點，在斑馬魚胚胎中，CDR1as的過表達造成中腦體積減少，且中腦體積的減少可通過注射miR-7前體得以部分恢復，這表明CDR1as的生物學效應至少部分通過其與miR-7相互作用而產生[4]。CDR1as是miR-7的環狀抑制劑，對miR-7起負調控作用，可通過調控miR-7以影響腫瘤的產生[15]，發揮天然miRNA海綿功能[16]。此外， CDR1as亦可能與帕金森病有關[6]，Lukiw等[17]發現在ciRS-7(也被稱為CDR1as)的海綿功能缺失時，miR-7表達上調，極有可能下調阿爾茨海默病相關靶點蛋白表達，如泛素化蛋白連接酶A[18-19]。睪丸特異性基因Sry 的circRNA具有16個miR-138的靶位點，可與miR-138相互作用，充當miR-138海綿[4]。circRNA cANRIL是基因INK4/ARF的反義轉錄物[20]，可通過有差異的PcG募集來抑制INK4/ARF表達，從而參與動脈粥樣硬化發生的調控機制[7]。

本研究發現，與常氧組比較，HPH模型組肺組織中表達顯著上調或下調的circRNAs分別有23個和41個，提示circRNA可能調控HPH發生發展。上述差異表達的circRNAs還需要進一步的實驗加以驗證，而相關的作用機制也將要通過circRNA/miRNA交互作用的研究來闡明。具體而言，借助LOF/GOF操作，下調或上調細胞circRNA表達，觀察小鼠HPH特征變化，明確circRNA在HPH中的功能；觀察circRNA吸附特定miRNA從而影響mRNA表達，circRNA芯片與mRNA表達譜芯片聯合分析，研究circRNA、miRNA和mRNA三者關系，探明miRNA海綿機制；RIP或ChRIP證明circRNA、miRNA和Ago2蛋白相結合，深度闡明circRNA調節HPH的機制；用臨床標本驗證circRNA表達變化，以確定HPH生物學標志物。上述有待開展的研究將為闡明HPH的發生發展機制、明確干預靶點和確定臨床診斷標志物提供科學依據。

1 McLaughlin VV, Archer SL, Badesch DB, et al. ACCF/AHA 2009 expert consensus document on pulmonary hypertension a report of the American College of Cardiology Foundation Task Force on Expert Consensus Documents and the American Heart Association developed in collaboration with the American College of Chest Physicians; American Thoracic Society, Inc.; and the Pulmonary Hypertension Association[J]. J Am Coll Cardiol, 2009, 53(17): 1573-1619.

2 夏世金, 吳俊珍, 胡明冬. 低氧致炎與低氧性肺動脈高壓[J/CD]. 中華肺部疾病雜志：電子版, 2014, 7(5): 563-565.

3 夏世金, 高文, 胡明冬, 等. 環狀RNA的研究現狀及展望[J/CD]. 中華肺部疾病雜志：電子版, 2014, 7(6): 670-673.

4 Hansen TB, Jensen TI, Clausen BH, et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges [J]. Nature, 2013, 495(7441): 384-388.

5 Memczak S, Jens M, Elefsinioti A, et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency[J]. Nature, 2013, 495(7441): 333-338.

6 Ghosal S, Das S, Sen R, et al. Circ2Traits: a comprehensive database for circular RNA potentially associated with disease and traits [J]. Front Genet, 2013, 4: 283.

7 Burd CE, Jeck WR, Liu Y, et al. Expression of linear and novel circular forms of an INK4/ARF-associated non-coding RNA correlates with atherosclerosis risk [J]. PLoS Genet, 2010, 6(12): e1001233.

8 Cocquerelle C, Mascrez B, Hétuin D, et al. Mis-splicing yields circular RNA molecules [J]. FASEB J, 1993, 7(1): 155-160.

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(本文編輯：王亞南)

夏世金，邰先桃，李 炳，等. 低氧性肺動脈高壓小鼠肺的環狀RNA表達譜研究[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2015， 8(1)： 40-44.

·醫學動態·

監測腫瘤狀態的特殊基因

近日，來自Mount Sinai Medical Center的研究人員通過研究發現兩種癌癥藥物可以開啟特殊基因的表達，而這種特殊基因則可以告知腫瘤細胞使其處于休眠狀態。

當名為NR2F1的基因開啟后其就會重編程腫瘤細胞使其處于休眠狀態；而當該基因的表達關閉后腫瘤細胞就會開始分裂并且發生異常生長，從而潛在地使休眠中的細胞迅速生長成為腫瘤，并且發生全身性的轉移。研究者表示，將抗癌藥物氮雜胞苷和類維生素A進行結合就可以明顯增加腫瘤細胞中活性NR2F1的水平。

NR2F1作為腫瘤細胞生長的主要調節基因，其影響著決定細胞是否處于休眠的許多基因的表達；本文研究顯示，基因NR2F1在人類胚胎干細胞中發揮著長期的控制作用，在干細胞中其可以指揮細胞停止生長并且變成對生命活動重要的細胞，而NR2F1的這種功能也使其對腫瘤細胞可以施加較長的控制效應，當癌細胞從原發性位點增殖擴散后NR2F1就會促進癌細胞保持休眠狀態。

Study of circular RNA expression profile of lungs in the mice with hypoxia-induced pulmonary hypertension

XiaShijin1,TaiXiantao2,LiBing3,SuJinyan2,DiHua2,LiuLumei1,WanWenbin4,HuMingdong5(1ShanghaiInstituteofGeriatrics,HuadongHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China；2SchoolofAcupuncture,MassageandRehabilitation,YunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Kunming650500,China；3CentralLaboratory,JinshanHospital,FudanUniversity,Shanghai201508,China；4DepartmentofNeurology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China；5DepartmentofRespiratoryDiseases,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China)

HuMingdong,Email：huhanshandd@aliyun.comandTaiXiantao,Email：taixiantao@163.com

Objective To use mouse circRNA microarray to screen the differential expression of circRNA of lungs in the mice with hypoxia-induced pulmonary hypertension(HPH) and to study of circRNA expression profile in order to offer the research approach for HPH mechanism. Methods 20 healthy male C57BL/6 mice (weighing 17-20 g) were randomly divided into HPH model group and normoxic group, 10 mice each group. The mice of the HPH model group were exposed to normobaric hypoxia [(10±0.5)%O2environment)] in a ventilated hypoxic cabin for 21 days, whereas age-matched and weight-matched normoxic mice were maintained in a virus-free room with normoxic environment. The mice were sacrificed and the lung tissue was obtained from the HPH mice model group which was successfully replicated by measuring right ventricular pressure and index of right ventricular hypertrophy. The circRNA expression profiles of lung tissue in the two groups were detected by using the mouse circRNA microarray. The differential expression of circRNAs of lungs between the two groups were clarified via comparison and analysis of the circRNA expression profiles. Results Compared with the normoxic group, 23 up-regulated circRNAs and 41 down-regulated circRNAs were found in lung tissues of the HPH model group (P<0.01,P<0.05). Conclusions circRNA microarray can be used for screening the differential circRNA expression of HPH, and circRNA may be involved the regulatory mechanisms underlying HPH.

Circular RNA; Hypoxia-induced pulmonary hypertension; Mouse; Lung; Microarray; Non-coding RNA; Alternative splicing; microRNA

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.01.009

國家自然科學基金(81270115，81460748)

200040 上海，復旦大學附屬華東醫院上海市老年醫學研究所1650500 昆明，云南中醫學院針灸推拿康復學院2201508 上海，復旦大學附屬金山醫院中心實驗室3200032 上海，復旦大學附屬中山醫院神經內科4400037 重慶，第三軍醫大學新橋醫院呼吸內科5

胡明冬，Email：huhanshandd@aliyun.com 邰先桃，Email: taixiantao@163.com

R563

A

2015-01-13)