白介素13受體α2在哮喘小鼠肺組織細(xì)胞內(nèi)表達(dá)與氣道重塑的關(guān)系

王正東 姚漢清 閔凌峰 徐興祥

·論著·

白介素13受體α2在哮喘小鼠肺組織細(xì)胞內(nèi)表達(dá)與氣道重塑的關(guān)系

王正東 姚漢清 閔凌峰 徐興祥

目的探討白介素13受體α2(IL-13Rα2)與氣道重塑的的關(guān)系。方法用OVA腹腔注射致敏SPF級BALB/c小鼠，霧化吸入激發(fā)制作哮喘模型，同時予地塞米松腹腔注射干預(yù)，最后一次致敏后24 h處死小鼠，觀察并測量肺組織形態(tài)學(xué)改變，用RT-PCR和免疫組化法分別檢測小鼠肺組織中IL-13Rα2 mRNA和蛋白的表達(dá)及TGF-β1 mRNA表達(dá)。結(jié)果哮喘小鼠與對照組、地塞米松組小鼠比較，支氣管管壁 (17.58±0.78)vs. (12.61±0.87)vs. (13.89±0.94)、平滑肌面積 (6.71±0.83)vs. (4.61±0.46)vs. (5.62±0.53)均明顯增加，P<0.01，RT-PCR發(fā)現(xiàn)肺組織中IL-13Rα2 mRNA (0.670±0.183)vs. (0.075±0.058)vs. (0.262±0.138) 和TGF-β1 mRNA (0.704±0.168)vs. (0.317±0.140)vs. (0.358±0.098) 明顯增高，P<0.01，免疫組化發(fā)現(xiàn)IL-13Rα2蛋白表達(dá) (52.11±6.30)vs. (17.80±4.09)vs. (22.87±3.76) 明顯增高，P<0.01。結(jié)論IL-13Rα2在哮喘小鼠肺組織表達(dá)增加，與氣道重塑密切相關(guān)。

支氣管哮喘； 氣道重塑； 白細(xì)胞介素13； 受體

氣道重塑是支氣管哮喘(以下簡稱哮喘)的重要特征，氣道重塑與Th2細(xì)胞因子(IL-4、 IL-5、IL-13)的激活密切相關(guān)，IL-13可單獨誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生哮喘的所有癥狀。IL-13受體有兩個亞型：白介素13受體α2(interleukin-13 receptor α2, IL-13Rα2)和IL-13Rα2。IL-13Rα2在肺上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。本實驗就哮喘小鼠中IL-13Rα2和氣道重塑關(guān)系作一研究，旨在進(jìn)一步探討哮喘的發(fā)病機制。

材料與方法

一、實驗材料

健康BALB/c小鼠(8周齡，雄性，SPF級，體質(zhì)量18～22 g，30只(斯萊克實驗動物公司，上海)。試劑：氫氧化鋁佐劑(上海化工總廠)，雞卵蛋白OVA (Ⅱ級，sigma公司，美國)，羊抗鼠IL-13Rα2抗體(R&D公司，美國)，生物素標(biāo)記第二抗體(邁新公司，福州) ，RT-PCR試劑盒(Fermentas公司，美國)，Trizol試劑(Invitrogen公司，美國)。

二、實驗方法

1. 哮喘動物模型的制備： ①按照隨機原則將30只小鼠分為3組，對照組(A組，n=10)、哮喘組 (B組，n=10)、干預(yù)組 (C組，n=10)；②致敏：將OVA和氫氧化鋁制成生理鹽水抗原混懸液(濃度OVA 0.01%,氫氧化鋁0.01%)，第0、7天每只小鼠腹腔內(nèi)注射0.1 ml；③激發(fā)，霧化吸入1%OVA激發(fā)小鼠哮喘，開始時間第14天，頻率每周第1、3、5天，每次霧化持續(xù)時間20 min，共計8周[1]。干預(yù)：每日激發(fā)前30 min，C組小鼠腹腔注射地塞米松2 mg/kg。A組以生理鹽水代替抗原混懸液及1% OVA進(jìn)行腹腔注射和霧化。

2. 肺組織病理和形態(tài)學(xué)觀察及測量： 末次霧化后24 h斷頸椎方法處死小鼠，取左肺常規(guī)制備病理切片，HE染色后觀察病理改變。選擇橫斷面完整的且長徑:短徑<1.5的氣管， QWin圖像系統(tǒng)分析管腔的內(nèi)周長(Pi)、管壁面積(Wat)、支氣管平滑肌的面積(Wam)，用Pi對Wat、Wam值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

3. IL-13Rα2 mRNA 和TGF-β1 mRNA表達(dá)水平的測量: Trizol試劑提取右肺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA獲得模板行PCR擴(kuò)增。目的基因引物序列：IL-13 Rα2上游：5′- ACGATAGGTACGCATTTGT

C-3′，下游：5′- GCAAGTGAAGACGTATGCTT-3′，煺火溫度58 ℃，PCR 產(chǎn)物908bp。TGF-β1上游：5′-TAATCAGCACTATCACCTACCT-3′，下游：5′-TGGTA

AAGAGCTCACCCGCGTG-3′，煺火溫度58 ℃，PCR 產(chǎn)物492bp。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用Band Leader 3.0軟件半定量分析PCR產(chǎn)物的相對A值。

4. IL-13Rα2蛋白表達(dá)的測量: 左肺組織石蠟切片脫水，3%雙氧水溶液室溫處理10 min后，正常羊血清封閉，依次滴加一抗、二抗、SABC，DAB顯色，陽性結(jié)果顯示棕黃色。用PIPS22020軟件進(jìn)行分析。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、氣道重塑圖像分析結(jié)果

B組小鼠肺組織Wat/Pi值和Wam/Pi值顯著高于A組(P<0.01)和C組(P<0.01)，A組Wat/Pi值和Wam/Pi值顯著高于C組(P<0.01)，見表1。Wat/Pi值結(jié)果：A組(12.61±0.87) μm2/μm，B組(17.58±0.78) μm2/μm，C組 (13.89±0.94) μm2/μm，B組Wat/Pi較A組明顯增加，比較兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。C組和B組比較有顯著差異(P<0.01)，C組和A組比較也有顯著差異(P<0.01)。Wam/Pi值結(jié)果：A組(4.61±0.46)μm2/μm，B組(6.71±0.83)μm2/μm，C組(5.62±0.53) μm2/μm，B組較A組明顯增加，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。C組和B組比較有顯著差異(P<0.01)，C組和A組比較亦存在顯著差異(P<0.01)，見表1。

表1 三組小鼠肺組織Wat/Pi值和Wam/Pi值測量結(jié)果的比較

二、IL-13Rα2 mRNA、TGF-β1 mRNA的表達(dá)結(jié)果

B組小鼠肺組織IL-13Rα2 mRNA的表達(dá)和TGF-β1 mRNA的表達(dá)顯著高于A組(P<0.01)和C組(P<0.01)，C組IL-13Rα2 mRNA的表達(dá)顯著高于A組(P<0.01)，C組與A組間TGF-β1 mRNA的表達(dá)無顯著差異(P>0.05)，見表2。IL-13Rα2 mRNA的表達(dá)：A組(0.075±0.058)，B組(0.670±0.183)，C組(0.262±0.138)，B組顯著高于A組(P<0.01)和C組(P<0.01)，C組顯著高于A組(P<0.05)，低于B組(P<0.01)。TGF-β1 mRNA的表達(dá)：A組(0.317±0.140)，B組(0.704±0.168)，C組(0.358±0.098)，B組顯著高于A組(P<0.01)和C組(P<0.01)，C組與A組之間無顯著差異(P>0.05)，見表2。

表2 三組小鼠肺組織IL-13Rα2 mRNA、TGF-β1 mRNA表達(dá)水平的比較

三、IL-13Rα2蛋白表達(dá)結(jié)果

免疫組化染色I(xiàn)L-13Rα2蛋白陽性，顯微鏡下顯示有棕黃色顆粒沉著。氣道炎性細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)及支氣管上皮細(xì)胞內(nèi)均可見到棕黃色顆粒沉著。小鼠氣道陽性細(xì)胞灰度值：A組(17.80±4.09)，B組(52.11±6.30)，C組(22.87±3.76)。B組顯著高于A組(P<0.01)和C組(P<0.01)，C組顯著高于A組(P<0.01)，見表2及圖1～3。

圖1 A組肺組織IL-13Rα2蛋白表達(dá)(免疫組化，×400)

圖2 B組肺組織IL-13Rα2蛋白表達(dá)(免疫組化，×400)

圖3 C組肺組織IL-13Rα2蛋白表達(dá)(免疫組化，×400)

討 論

氣道重塑是導(dǎo)致哮喘患者肺功能惡化、致殘和死亡的重要原因[2]。多種細(xì)胞和細(xì)胞因子共同參與的氣道慢性炎癥過程中，持續(xù)的氣道損傷和修復(fù)最終導(dǎo)致氣道重塑。哮喘支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中轉(zhuǎn)移生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)和IL-13的水平是顯著升高[3]。研究證實TGF-β改變氣道上皮細(xì)胞之間的黏附性能，誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞的凋亡，是氣道上皮細(xì)胞層的損傷重要因素。同時TGF-β促進(jìn)黏液腺和杯狀細(xì)胞的增生、促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖、分化及分泌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular cell matrix, ECM)蛋白[4]，促進(jìn)氣道平滑肌的增殖和細(xì)胞肥大，促進(jìn)氣道血管的增殖和重塑。TGF-β的一系列生物學(xué)功能決定TGF-β在氣道重塑中的重要作用。IL-13是Th2細(xì)胞分泌的多效應(yīng)細(xì)胞因子，能促進(jìn)B細(xì)胞增殖和抗體分泌，在IgE介導(dǎo)的I型變態(tài)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，同時也參與氣道的重塑[5-6]。研究提示IL-13和TGF-β1的共同作用在慢性炎癥導(dǎo)致組織纖維化過程中至關(guān)重要。

IL-13的受體有兩類：IL-13Rα1和IL-13Rα2。IL-13Rα1作為重要的效應(yīng)受體已經(jīng)得到多項研究證實。IL-13Rα2在正常肺組織中表達(dá)很低，但I(xiàn)L-13Rα2和IL-13的親和力(KD=250 pm)約是IL-13Rα1和IL-13親和力(KD=2～10 nm)的100倍，其與IL-13的功能密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)哮喘組小鼠肺組織IL-13Rα2 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯升高，并且與TGF-β1 mRNA、氣道壁的厚度和氣道壁平滑肌厚度變化密切相關(guān)。地塞米松治療組小鼠肺組織中TGF-β1 mRNA表達(dá)下降，氣道壁的厚度和氣道壁平滑肌厚度改善，并且與IL-13Rα2 mRNA和蛋白表達(dá)變化一致。提示IL-13Rα2參與IL-13介導(dǎo)的氣道重塑過程，但其作用尚有待進(jìn)一步研究[7]。

IL-13Rα2在細(xì)胞漿、細(xì)胞膜(mIL-13Rα2)和細(xì)胞間隙中(sIL-13Rα2)均有存在。IL-13Rα2的三個形式存在聯(lián)系，體外試驗發(fā)現(xiàn)IL-13Rα2被自發(fā)地從細(xì)胞內(nèi)釋放到培養(yǎng)基中，在細(xì)胞間隙和血漿中以可溶性形式存在。Wang等[8]報告感染血吸蟲的IL-13Rα2基因缺陷小鼠，肺部和肝臟出現(xiàn)組織纖維化，且較正常小鼠嚴(yán)重。史廣海等[9]使用重組sIL-13Rα2治療支氣管哮喘小鼠，發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡加速，氣道炎癥減輕。因此sIL-13Rα2可能是IL-13誘餌受體，具有中和IL-13的效應(yīng)。但國外有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)IL-13通過IL-13Rα2誘發(fā)同種異體肝移植小鼠發(fā)生TGF-β1相關(guān)的慢性移植排斥反應(yīng)，造成移植肝發(fā)生纖維化改變。IL-13Rα2 siRNA可以阻斷IL-13/TGF-β1作用防止移植物發(fā)生纖維化[10]。IFN-γ是組織纖維化的抑制因子，在體外IFN-γ通過動員細(xì)胞內(nèi)的IL-13Rα2增加mIL-13Rα2表達(dá)[11]，但I(xiàn)L-13和IL-4也能上調(diào)氣道上皮細(xì)胞IL-13Rα2 mRNA表達(dá)。mIL-13Rα2和sIL-13Rα2可能在機體內(nèi)發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)。

現(xiàn)有研究證實sIL-13Rα2可能是誘餌受體。mIL-13Rα2能否通過激活STAT6信號通路發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)尚不清楚[12]。研究發(fā)現(xiàn)mIL-13Rα2細(xì)胞漿很短不能結(jié)合JAKs或STATs，因此不能激活STAT6信號通路。但有研究發(fā)現(xiàn)IL-13Rα2細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域存在一個包含磷酸化位點Y369PKM的氨基酸殘基，這個磷酸化位點具有潛在的結(jié)合含SH2信號分子的能力[13]。mIL-13Rα2有可能通過SH2信號分子激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1 (activating protein 1)而發(fā)揮生理效應(yīng)[7]。

綜上所述，IL-13Rα2是哮喘氣道重塑過程的重要參與者。但由于IL-13Rα2在體內(nèi)以三種形態(tài)存在，這三種形態(tài)可以密切聯(lián)系。進(jìn)一步研究這三種形態(tài)在轉(zhuǎn)化過程中的影響因素，以及mIL-13Rα2和sIL-13Rα2各自的功能，對進(jìn)一步闡明哮喘的發(fā)病機制有重要的意義。

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3 李 蓓, 王 敏. 轉(zhuǎn)化因子-β與結(jié)締組織生長因子在哮喘氣道重構(gòu)中的作用[J]. 臨床肺科雜志, 2009, 14(10): 1346-1348.

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(本文編輯：黃紅稷)

王正東，姚漢清，閔凌峰，等. 白介素13受體α2在哮喘小鼠肺組織細(xì)胞內(nèi)表達(dá)與氣道重塑的關(guān)系[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2015， 8(1)： 35-38.

·醫(yī)學(xué)動態(tài)·

抑制EZH2治療肺癌新發(fā)現(xiàn)

近日，來自美國波士頓兒童醫(yī)院的科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，抑制甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2對應(yīng)用化療藥物治療EGFR和BRG1突變與非突變非小細(xì)胞肺癌具有不同影響。

非小細(xì)胞肺癌是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致癌癥致死的主要殺手，應(yīng)用拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑依托泊苷只對一小部分患有非小細(xì)胞肺癌的病人具有良好療效，因此，改變藥物作用靶點正成為藥物治療該疾病的主要問題。研究證明EZH2能與PRC2共同作用對H3K27進(jìn)行三甲基化，起到基因沉默的作用，因此甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2成為一個非常具有應(yīng)用前景的潛在作用靶點。

Christine等發(fā)現(xiàn)抑制EZH2對應(yīng)用拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑治療EGFR和BRG1突變與非突變非小細(xì)胞肺癌具有不同影響。在BRG1失活的腫瘤細(xì)胞中，抑制EZH2會影響細(xì)胞周期導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡以及對拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑的敏感性增加，同時EGFR功能獲得型突變的腫瘤細(xì)胞對抑制EZH2以及拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑的敏感性都增加。而在野生型EGFR和BRG1腫瘤細(xì)胞中，抑制EZH2會上調(diào)BRG1表達(dá)導(dǎo)致對拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑的抵抗。

Relationship between interleukin-13 receptor α2 expression and airway remodeling in asthmatic mice

WangZhengdong,YaoHanqing,MinLingfeng,XuXingxiang(DepartmentofRespiratoryMedicine,NorthernJiangsuPeople′sHospital,Yangzhou225001,China)

XuXingxiang,Email:xuxx63@sina.com

Objective To investigate the relationship between interleukin-13 receptor α2(IL-13Rα2) and airway remodeling. Methods SPF level BALB/c mice were injected with OVA intraperitoneal by sensitization, and inhalation stimulation, and dexamethasone intervention by intraperitoneal injection. Mice were sacrificed 24 h after the last sensitization. It was observed that morphological changes in mice lung tissue. IL-13 Rα2 mRNA , TGF-β1 mRNA and IL-13 Rα2 protein expression in mice lung tissues were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) and immunohistochemisty respectively. Results Compared with the control group, dexamethasone group, the bronchial wall of asthmatic mice became thicker (17.58±0.78)vs. (12.61±0.87)vs. (13.89±0.94),P<0.01, and their smooth muscle area was much thicker too (6.71±0.83)vs. (4.61±0.46)vs. (5.62±0.53),P<0.01. RT-PCR found that IL-13R α 2 mRNA (0.670±0.183)vs. (0.075±0.058)vs. (0.262±0.138) and TGF-β1 mRNA (0.704±0.168)vs. (0.317±0.140)vs. (0.358±0.098) significantly increased in lung tissue,P<0.01, and immunohistochemistry showed that IL-13Rα 2 protein expression (52.11±6.30)vs. (17.80±4.09)vs. (22.87±3.76) was evidently higher,P<0.01. Conclusion The expression of IL-13 Rα2 in asthmatic mice lung tissue is increased, which has close relationship with airway remodeling.

Bronchial asthma; Airway remodeling; Interleukin-13; Receptor

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.01.008

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(81302016)

225001 揚州，江蘇省蘇北人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科

徐興祥，Email: xuxx63@sina.com

R563

A

2014-12-19)