三種不同方法轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞效果比較

顏文杰 孫文逵,2 李 培,2 蘇 欣,2 施 毅,2

·論著·

三種不同方法轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞效果比較

顏文杰1孫文逵1,2李 培1,2蘇 欣1,2施 毅1,2

目的探討通過腺病毒，慢病毒，脂質(zhì)體2000三種方法轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞的最佳方法。方法采用腺病毒，慢病毒，脂質(zhì)體2000三種方法分別轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞，并用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染熒光表達(dá)情況，流式細(xì)胞儀檢測THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞病死率。結(jié)果腺病毒對THP-1巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率可在對細(xì)胞損傷較小的情況下達(dá)較高水平，但可能對細(xì)胞免疫狀態(tài)影響大。MOI=200時(shí)，轉(zhuǎn)染效率較低，僅為(29.81±2.50)%，細(xì)胞病死率為(5.17±0.44)%；MOI=800，轉(zhuǎn)染效率最高，EGFP陽性率可達(dá)(86.49±6.11)%,細(xì)胞病死率為(8.80±0.54)%；MOI 升至1200后，EGFP陽性率為(77.88±5.77)%， 細(xì)胞病死率上升明顯(14.50±0.77)%(P<0.05)；慢病毒轉(zhuǎn)染效率高及細(xì)胞毒性較腺病毒低，但因其病毒產(chǎn)量低，實(shí)驗(yàn)消耗病毒量大，因而影響其應(yīng)用。當(dāng)MOI=10時(shí)， EGFP陽性率僅為(28.09±1.67)%, 細(xì)胞病死率為(4.74±0.31)%；MOI=60時(shí)，轉(zhuǎn)染率最高，EGFP陽性率為(91.96±1.66)%，細(xì)胞病死率升至(7.25±0.50)%，此時(shí)病死率才有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。脂質(zhì)體2000對THP-1巨噬細(xì)胞毒性較大，細(xì)胞死亡率高，轉(zhuǎn)染效率極低，不適合轉(zhuǎn)染。結(jié)論腺病毒與慢病毒轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞各存在一定優(yōu)劣，在實(shí)驗(yàn)中需酌情選擇，脂質(zhì)體2000不適宜轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞。

THP-1巨噬細(xì)胞； 腺病毒； 慢病毒； 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

THP-1懸浮細(xì)胞為人白血病單核細(xì)胞系，屬于血液系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞范疇，佛波酯(PMA)能夠誘導(dǎo)THP-1貼壁，并在48 h左右分化成熟，生成THP-1巨噬細(xì)胞[1-3]。THP-1巨噬細(xì)胞為終末細(xì)胞，喪失增殖分化能力，在光鏡下可見其緊密貼壁，呈現(xiàn)梭形或者多形性，并有偽足形成，電鏡下則可見胞漿內(nèi)線粒體及溶酶體的數(shù)量較之THP-1懸浮細(xì)胞明顯增加。此外其表面的分子標(biāo)志物如CD206等以及抗凋亡蛋白MCl-1的含量均與人單核細(xì)胞來源巨噬細(xì)胞(monocyte-derived macrophages，MDM)近似。THP-1巨噬細(xì)胞具有模式識別受體，能夠識別并吞噬病原體，分泌炎癥相關(guān)細(xì)胞因子，并啟動后續(xù)的炎癥反應(yīng)過程[4]。國外已有采用THP-1巨噬細(xì)胞作為巨噬細(xì)胞感染模型的報(bào)道[5-7]。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指利用物理化學(xué)及生物介導(dǎo)等手段將外源分子如DNA，RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。常見的轉(zhuǎn)染技術(shù)包括病毒轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及顯微注射、電穿孔轉(zhuǎn)染等方式。其中病毒轉(zhuǎn)染具有操作簡便，轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞病死率低的優(yōu)勢，但是構(gòu)建載體步驟復(fù)雜，成本高昂。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染成本低廉，但是細(xì)胞毒性大，對細(xì)胞的正常生理活性影響嚴(yán)重。而顯微注射、電穿孔等物理轉(zhuǎn)染方法因設(shè)備昂貴，對人員技術(shù)操作要求高等因素，限制了其在實(shí)踐中的應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)擬通過腺病毒，慢病毒，脂質(zhì)體2000三種方法分別轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞，探討轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞的最佳方法，為THP-1巨噬細(xì)胞相關(guān)感染實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。

材料和方法

一、主要材料與試劑

人THP-1細(xì)胞來源于南京軍區(qū)南京總醫(yī)院呼吸內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室；胰酶：碧云天公司；1640細(xì)胞培養(yǎng)基(維森特公司)；OPTI培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(維森特公司);佛波酯(碧云天公司); 無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(OMEGA公司)；脂質(zhì)體 2000(Invitrogen公司)；人E5型腺病毒及慢病毒(購自上海銳賽公司)。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

THP-1懸浮細(xì)胞采用90%1640細(xì)胞培養(yǎng)基(維森特)+10%胎牛血清(維森特)+1%青霉素和鏈霉素(Gibco BRL)配置的1640完全培養(yǎng)液。設(shè)定細(xì)胞箱培養(yǎng)環(huán)境為飽和濕度，37 ℃，5% CO2濃度。根據(jù)THP-1細(xì)胞生長速度采用半定量換液或離心換液每1～2 d換液一次。在THP-1細(xì)胞經(jīng)由佛波酯誘導(dǎo)貼壁后，細(xì)胞培養(yǎng)液及培養(yǎng)環(huán)境與THP-1懸浮細(xì)胞相同，換液方式采取每日棄去部分舊培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)液。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1. PMA誘導(dǎo)THP-1懸浮細(xì)胞貼壁: 將PMA 4.5 μl加至45 ml 1640培養(yǎng)液中，配置為母液，保存在4 ℃冰箱中，并于1月內(nèi)使用完畢。在使用時(shí)，依次將純1640培養(yǎng)基，PMA母液， THP-1懸浮細(xì)胞加入培養(yǎng)板中，吹打混勻，最終使得PMA母液占總體積的1/10。24 h后觀察貼壁及細(xì)胞匯合度，如細(xì)胞貼壁不佳，丟棄培養(yǎng)板，如細(xì)胞貼壁良好，更換1640純培養(yǎng)基為1640無抗生素完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24～48 h。

2. 脂質(zhì)體2000介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞： 將1×106個(gè)數(shù)量的細(xì)胞接種6孔板中，PMA誘導(dǎo)48 h，貼壁成功。將轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基、質(zhì)粒，脂質(zhì)體2000等自冰箱取出，復(fù)蘇至室溫。稀釋4.0 μg質(zhì)粒DNA至250 μl OPTI培養(yǎng)基中混勻；稀釋10 μl脂質(zhì)體至250 μl OPTI培養(yǎng)基中混勻，靜置5 min，上述配置液體混合25 min，均勻加入已處理貼壁及更換無抗生素培養(yǎng)基的目標(biāo)細(xì)胞孔中。6 h吸出轉(zhuǎn)染液，PBS輕柔吹洗1遍，更換為1640完全培養(yǎng)液。24～48 h后觀察熒光。

3.慢病毒及腺病毒轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞： THP-1細(xì)胞計(jì)數(shù)后，PMA誘導(dǎo)鋪板。選擇24孔板鋪板，每個(gè)孔細(xì)胞量為1.5×105/孔，24 h后換液，再培養(yǎng)24 h，并于鏡下觀察鋪板成功后，將培養(yǎng)液吸出，PBS清洗2遍，將配好的不同感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)的不含血清的1640/病毒(腺病毒MOI分別為200,500,800,1200；慢病毒MOI分別為10,20,40,60)混合液均勻加入孔中。15 h后換液，更換為完全1640培養(yǎng)基。48 h熒光顯微鏡觀察熒光。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率： 在慢病毒及腺病毒轉(zhuǎn)染72 h，脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染36 h后，將轉(zhuǎn)染后THP-1巨噬細(xì)胞采用PBS清洗2遍，胰酶消化細(xì)胞2 min，1640完全培養(yǎng)基終止消化后，以離心半徑8 cm，1200 r/min，離心5 min，棄除上清液，再次PBS重懸細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測上述細(xì)胞懸液強(qiáng)化綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)表達(dá)情況。

5. 臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞病死率：采用雙蒸水配置濃度4%臺盼藍(lán)，并于冰箱4 ℃保存。使用前，首先將母液用PBS稀釋至0.4%，并復(fù)蘇至室溫。將轉(zhuǎn)染后的THP-1巨噬細(xì)胞采用PBS清洗2遍，胰酶消化細(xì)胞1.5 min，1640完全培養(yǎng)基中止消化，以離心半徑8 cm，1200 r/min，離心5 min，棄除上清液后，PBS重懸細(xì)胞。將細(xì)胞懸液與前面配置的0.4%臺盼藍(lán)溶液以9︰1混勻，最終使得混合液臺盼藍(lán)終濃度為0.04%，吸取10 μl染色細(xì)胞懸液至細(xì)胞計(jì)數(shù)板，并在3 min內(nèi)，光鏡下觀察，計(jì)數(shù)藍(lán)色染色的死細(xì)胞，及呈無色透明狀的活細(xì)胞。細(xì)胞病死率(%)=染色細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、腺病毒轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞分析

光鏡下，可見腺病毒轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞形態(tài)、透光度良好，未見明顯大片細(xì)胞死亡，及細(xì)胞碎片形成。熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測可見隨著腺病毒轉(zhuǎn)染的MOI濃度增加，EGFP陽性細(xì)胞比例逐漸升高，轉(zhuǎn)染效率不斷增加，但至MOI=1200時(shí)，則略有所下降，見圖1、2。

圖1 熒光顯微鏡檢測不同MOI下腺病毒轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞比較

MOI為200時(shí)，轉(zhuǎn)染效率較低，僅為(29.81±2.50)%，細(xì)胞病死率為(5.17±0.44)%；當(dāng)MOI在800時(shí)，此時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高，EGFP陽性率可達(dá)(86.49±6.11)%，細(xì)胞病死率為(8.80±0.54)%；而當(dāng)MOI提高至1200后，轉(zhuǎn)染效率則有所下降，EGFP陽性率為(77.88±5.77)%，此時(shí)細(xì)胞病死率則上升明顯，升至(14.50±0.77)%。組間差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

二、慢病毒轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞分析

光鏡下，可見慢病毒轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞同樣保持了良好的形態(tài)、透光度，視野內(nèi)無未見明顯大片細(xì)胞死亡。熒光顯微鏡下可見隨著慢病毒轉(zhuǎn)染的MOI濃度增加，EGFP陽性細(xì)胞比例逐漸升高，轉(zhuǎn)染效率不斷增加，至MOI=60時(shí)，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最高，此結(jié)果與流式細(xì)胞儀數(shù)值一致, 見圖3、4。

圖3 熒光顯微鏡檢測不同MOI下慢病毒轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞效率比較

圖2 流式細(xì)胞儀檢測腺病毒轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞EGFP陽性率

圖4 流式細(xì)胞儀檢測慢病毒轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞EGFP陽性率

當(dāng)MOI在10時(shí)，此時(shí)EGFP陽性率僅為(28.09±1.67)%，細(xì)胞病死率為(4.74±0.31)%；而當(dāng)MOI提高至40后，EGFP陽性率上升為(73.81±2.76)%，細(xì)胞病死率為(5.77±0.54)%；當(dāng)MOI=60時(shí)，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最高，EGFP陽性率為(91.96±1.66)%，細(xì)胞病死率則升至(7.25±0.50)%。提示隨著慢病毒MOI濃度提高，THP-1巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率逐漸上升，但同時(shí)細(xì)胞病死率上升趨勢不明顯，組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，直到MOI=60時(shí)，病死率差別才出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

三、脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞分析

脂質(zhì)體2000對THP-1巨噬細(xì)胞殺傷明顯，光鏡下見細(xì)胞變形，崩解，碎裂，大片細(xì)胞死亡，臺盼藍(lán)染色見細(xì)胞病死率在(47.87±4.67)%左右。且熒光鏡下及流式細(xì)胞儀均未見明顯熒光表達(dá)[流式細(xì)胞儀檢測EGFP陽性率為(2.39±0.21)%]，見圖5、6。

圖5 熒光顯微鏡檢測脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞效率

圖6 流式細(xì)胞儀檢測脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染后細(xì)胞EGFP陽性率

討 論

腺病毒屬于雙鏈DNA病毒，作為基因表達(dá)的載體，它具有諸多優(yōu)點(diǎn)，它能夠以較高的效率轉(zhuǎn)染入細(xì)胞(轉(zhuǎn)染效率通常在70%以上)，它能感染增殖及非增殖期的細(xì)胞，且因病毒基因組游離于核內(nèi)，不整合至細(xì)胞基因鏈中，病毒突變致癌風(fēng)險(xiǎn)小。目前新型的腺病毒載體的抗原性及細(xì)胞毒性已較野生株明顯降低，因而可以將其對細(xì)胞的影響減至最低，它所能夠插入的外源性基因片段也較長(可達(dá)8 kb)，此外它的構(gòu)建、制備成本低，價(jià)格低廉，且所獲得的病毒液滴度高(一般在1011～1012 pfu/ml)，因此腺病毒載體在細(xì)胞試驗(yàn)及基因治療中被廣泛應(yīng)用。但是腺病毒載體同時(shí)具有一定的缺點(diǎn)，它的抗原性較慢病毒載體免疫源性高，對細(xì)胞的免疫狀態(tài)影響大。它的細(xì)胞感染能力較其他病毒載體弱，所消耗病毒量大，且病毒生產(chǎn)的周期長，因此限制了其在實(shí)踐中的應(yīng)用[8]。在本實(shí)驗(yàn)中，腺病毒轉(zhuǎn)染效率最高達(dá)到了(84.69±6.11)%，體現(xiàn)了極高的轉(zhuǎn)染效率。但是與之對應(yīng)的是所需的病毒濃度明顯增高。為達(dá)到最佳轉(zhuǎn)染效率，所需的腺病毒MOI為800，這與其他文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相一致[9-11]。這種現(xiàn)象可能與吞噬細(xì)胞的免疫特性相關(guān)。巨噬細(xì)胞具有吞噬及溶解殺滅病原體的功能，人工改造的腺病毒載體雖然免疫源性較野毒株弱，但依然能夠引起吞噬，溶解、殺滅及炎癥募集等一系列免疫反應(yīng)[12-13]。有文獻(xiàn)報(bào)告在腺病毒感染過程中，轉(zhuǎn)錄因子PU.1的表達(dá)上調(diào)，能夠促進(jìn)免疫細(xì)胞的非特異性吞噬的作用[14]，并能夠抑制腺病毒進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，并促進(jìn)其在溶酶體內(nèi)溶解，從而顯著抑制腺病毒載體表達(dá)，起到免疫清除的作用[15]。這從一方面也解釋了THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染需要如此巨大病毒量的原因。

表1 腺病毒，慢病毒及脂質(zhì)體對THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率及病死率對比

注：三種轉(zhuǎn)染方法比較，P<0.05

慢病毒屬于RNA病毒，慢病毒載體與腺病毒載體相比較具有一定的優(yōu)點(diǎn)。它的轉(zhuǎn)染效率較腺病毒高(可達(dá)85%～100%)。它能夠?qū)⒒蚱握现了拗骷?xì)胞的染色體中，因而能夠穩(wěn)定、高水平表達(dá)，并能夠獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄株及轉(zhuǎn)基因動物。它具有較低的免疫原性，對細(xì)胞免疫狀態(tài)的影響小。它的轉(zhuǎn)染能力強(qiáng)，所消耗的病毒量小，特別是對于腺病毒難以轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞、原代細(xì)胞，慢病毒往往能夠以較高的效率轉(zhuǎn)錄。因此慢病毒載體在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及基因治療中均有著廣闊的前景[16-17]。但是慢病毒載體也存在一定的缺點(diǎn)，它可插入的外源性片段較小，一般不能超過2 kb，它的價(jià)格昂貴，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，生產(chǎn)條件一般的實(shí)驗(yàn)室難于具備。且一般公司能夠生產(chǎn)的最終滴度一般為109 TU/ml數(shù)量級，因而限制了其在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。考慮本實(shí)驗(yàn)需要的病毒量較大，以六孔板細(xì)胞鋪板量為106計(jì)算，在MOI=60的情況下，一個(gè)生產(chǎn)周期僅僅能夠提供數(shù)十個(gè)孔所需的病毒量。而且THP-1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞喪失了增殖活性，不能采用慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄篩選THP-1巨噬細(xì)胞系。因此慢病毒也難以作為THP-1細(xì)胞表達(dá)載體的首選。

脂質(zhì)體能夠與細(xì)胞膜發(fā)生融合，進(jìn)而產(chǎn)生內(nèi)吞作用，外源性DNA質(zhì)粒能夠被脂質(zhì)體包裹后，形成帶正電荷的復(fù)合體，并被細(xì)胞膜吸附及吞噬，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑因其廉價(jià)，操作簡便而在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中廣泛應(yīng)用。但是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染效率偏低，對部分細(xì)胞極其不敏感，且其具有明顯的細(xì)胞毒性。它能夠影響細(xì)胞的生理活性，干涉細(xì)胞的生理活動，影響細(xì)胞通路的正常進(jìn)行，例如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染會影響細(xì)胞的生理狀態(tài)及免疫情況。它能夠參與調(diào)節(jié)蛋白激酶C的通路，能夠顯著抑制ATP酶的活性，如與線粒體膜發(fā)生作用。此外，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染小干擾RNA有可能造成脫靶效應(yīng)甚至導(dǎo)致細(xì)胞的大量死亡。本實(shí)驗(yàn)中，THP-1巨噬細(xì)胞利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的效率極其低下，基本無目標(biāo)熒光蛋白表達(dá)，且其細(xì)胞毒性強(qiáng)，病死率極高，因此不考慮采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體2000對THP-1巨噬細(xì)胞毒性極大，細(xì)胞病死率可高達(dá)(47.87±4.67)%，轉(zhuǎn)染效率極低，僅為(2.39±0.21)%，不適合THP-1巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染。腺病毒細(xì)胞毒性較低的情況下具有極高的轉(zhuǎn)染效率(86.49±6.11)%，但是轉(zhuǎn)染最佳MOI明顯增高，因而對細(xì)胞免疫狀態(tài)影響大，有影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的風(fēng)險(xiǎn)，在載體選擇及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)要充分考慮。慢病毒相比腺病毒，其轉(zhuǎn)染效率進(jìn)一步提升，最高轉(zhuǎn)染效率可達(dá)(91.96±1.66)%，且同時(shí)病死率僅為(7.25±0.50)%，具有明顯的優(yōu)越性。但因其病毒產(chǎn)量低，實(shí)驗(yàn)消耗病毒量大，成本偏高因而影響其應(yīng)用。

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(本文編輯：王亞南)

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《中華肺部疾病雜志(電子版)》第二屆編輯委員會成員名單

顧 問： 程天民 王正國 鐘南山 樊代明

總 編 輯： 錢桂生

副總編輯： 王長征 白春學(xué) 孫耕耘 李為民 金發(fā)光 徐劍鋮 任成山(常務(wù))

編輯委員(以姓氏漢語拼音為序)

白春學(xué) 柏長青 包 勇 陳寶元 陳杭薇 陳和忠 陳良安 陳一強(qiáng)

程遠(yuǎn)雄 崔社懷 范賢明 馮飛躍 馮瑞娥 馮喜英 高加蓉 高培陽

郭喬楠 郭述良 洪志鵬 黃 江 黃 嵐 黃 茂 黃春基 黃華萍

黃文杰 解立新 金發(fā)光 康 健 賴克方 李 洪 李明嫻 李 琦

李 羲 李德閩 李福祥 李松柏 李濤平 李萬成 李為民 李志奎

梁宗安 林科雄 劉 翱 劉愛華 劉代順 劉書盈 劉曉民 劉 陽

馬 壯 閔家新 錢桂生 任成山 宋 勇 宋彩萍 宋元林 宋志芳

孫耕耘 唐鳳鳴 王 俊 王長征 王導(dǎo)新 王關(guān)嵩 王如文 王瑞蘭

王耀麗 王治平 文富強(qiáng) 翁國星 吳國明 席修明 夏前明 肖穎彬

熊建瓊 徐劍鋮 徐興祥 徐永健 徐志飛 徐志云 許建英 楊 康

楊生岳 楊栓盈 楊天德 葉小群 余 勤 張 波 張 羽 張國俊

張睢楊 張?zhí)焱?張獻(xiàn)全 張湘燕 趙 松 趙 珩 趙學(xué)維 趙云峰

支修益 周建英 周向東 鄒利光

編輯部主任： 任成山

Comparison of transfection of THP-1 macrophage by three different methods

YanWenjie1,SunWenkui1,2,LiPei1,2,SuXin1,2,ShiYi1,2(DepartmentofRespiratoryMedicine,1NanjingClinicalCollege,theSecondMilitaryMedicalUniversityofPLA,NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryAreaCommandofPLA,Nanjing210002,China；2NanjingUniversityClinicalSchoolofMedicine,Nanjing21000,China)

ShiYi,Email:shiyi56@126.com

Objective Three methods were used for transfection of THP-1 macrophage, which included adenovirus, lentivirus and liposome 2000. To research the optimal method for the transfection of THP-1 macrophage. Methods Adenovirus, lentivirus and liposome 2000 were used for transfection of THP-1 macrophage, fluorescence expression conditions of cell transfection were observed with a fluorescence microscope, the transfection efficiency of THP-1 cell was detected with a flow cytometry, and cell mortality rate was detected by trypan blue staining method. Results Adenovirus exhibited high transfection efficiency of THP-1 macrophage, and low cellular damage. But it may have strong effects on cellular immune conditions. MOI=200, transfection efficiency is lower(29.81±2.50)%, cell mortality is (5.17±0.44)%. MOI=800, transfection efficiency with the highest rate, EGFP positive rate is(86.49±6.11)%, cell mortality is(8.80±0.54)%. When MOI=1200, EGFP positive rate is(77.88±5.77)%, cell mortality increased significantly(14.50±0.77)%(P<0.05). Lentivirus with higher transfection efficiency and lower cellular damage than adenovirus, but low output and high consumption make it can′t be applied widely. When MOI=10, EGFP positive rate is (28.09±1.67)%, cell mortality is(4.74±0.31)%.MOI=60, transfection efficiency with the highest rate, EGFP positive rate is (91.96±1.66)%, cell mortality is(7.25±0.50)%,P<0.05. Lipid some 2000 had strong cytotoxic effects on THP-1 macrophage, cell mortality rate was high, and transfection efficiency was low, so the method is not suitable for transfection.Conclusions Adenovirus and lentivirus have their special advantages and disadvantages for transfection of THP-1 macrophage, selection of transfection method should according to special conditions of researches, generally, liposome 2000 is not suitable for transfection of THP-1 macrophage.

THP-1 macrophage； Adenovirus； Lentivirus； Transfection

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.01.003

國家自然科學(xué)基金(81270064)

210002 南京，中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)南京臨床學(xué)院 南京軍區(qū)南京總醫(yī)院呼吸與危重癥學(xué)科1210002 南京，南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院2

施 毅，Email: shiyi56@126.com

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2014-12-19)