一種華法林用藥指導的多重SNP檢測方法

顏進 南麗

(寧波海爾施基因科技有限公司 浙江寧波 315800)

一種華法林用藥指導的多重SNP檢測方法

顏進 南麗

(寧波海爾施基因科技有限公司 浙江寧波 315800)

目的：為患者提供一種華法林用藥指導的多重SNP檢測方案。方法：采用多重PCR和毛細管電泳片段分離技術，同步檢測人基因組DNA 的5個SNP位點的7個基因型。結果：14個基因型、3個人基因組DNA內參及1個PCR反應內參可以在同一個反應管中擴增，在毛細電泳時清晰分離。

華法林;SNP;個體化用藥

華法林是香豆素類口服抗凝血藥，在體內有對抗維生素K(Vk)的作用，可以抑制維生素K參與的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的在肝臟的合成，對血液中已有的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ并無抵抗作用。目前被廣泛應用于血栓栓塞性疾病的抗凝治療，但因治療窗窄，療效和不良反應個體差異很大，不同個體間華法林穩定劑量的差異可達20倍以上。據估計，服用華法林的患者中，每年有15.2%的人發生出血副作用，其中致命性的大出血占3.5%。研究發現，藥酶CYP2C9*2和*31、維生素K環氧化物還原酶復合體第1亞單位(VKORC1)的G-1639A［1］和C1173T［2］基因型、藥酶CYP4F2*3［3］、鈣控蛋白基因(CALU)rs339097［4］及γ-谷氨酰基羧化酶基因(GGCX)rs11676382［5］與華法林療效密切相關。華法林主要經由CYP2C9代謝，CYP2C9*2和*3基因突變導致酶活性降低從而使華法林代謝減慢，血液中華法林濃度過高，易出現出血等嚴重不良反應。華法林抑制VKORC1，從而發揮抗凝血作用，VKORC1的基因突變可使體內VKORC1的生成減少，進而對華法林的需求量下降，血液中華法林濃度相應升高，需要減少。CYP4F2是維生素K的氧化酶，突變減少了Vk的代謝，使Vk濃度升高，需要提高華法林劑量。CALU可調控VKORC1，突變患者需要增加華法林劑量。GGCX利用被VKORC1還原的Vk激活凝血因子，突變患者需要減少華法林劑量。

本研究開發了一種用于華法林用藥指導的多重基因檢測試劑盒，同步檢測與華法林用藥相關的5個基因7個SNP位點的等位基因型，為醫生和患者提供了一種華法林用藥指導的新型檢測方案。

1.材料和方法

DNA提取

以抗凝靜脈血作為樣本進行DNA提取。DNA提取在自動化提取工作站Smart LabAssist-32(臺灣圓點奈米技術有限公司)上完成。試劑盒使用"核酸自動提取試劑盒(磁珠法)"(寧波海爾施基因科技，貨號：1060055)。

PCR擴增

PCR擴增反應：華法林PCR預混液16μL、Taq DNA聚合酶2μL、樣品DNA/華法林陽性對照2μL。混勻后按以下溫度進行熱循環反應：94℃3分鐘;94℃30秒，60℃30秒，70℃30秒，共35個循環;72℃3分鐘;4℃保存產物。

DNA片段分離

采用遺傳分析儀(3500/3130，美國生命公司或GeXP，美國貝克曼庫爾特公司)進行DNA片段分離，詳見說明書。

2.結果

華法林試劑盒檢測人DNA樣品，因每個SNP位點有可能出現2個基因型峰，故共可能出現11-18個特征峰，其中7-14個為SNP特征峰、3個人DNA內參特征峰(B1-B3)和1個PCR反應內參pcDNA特征峰(圖1)。華法林陽性對照檢測結果應出現全部18個特征峰。

圖1 本試劑盒檢測人DNA樣品結果舉例。共出現12個特征峰：7個SNP位點只有1個雜合子(CYP4F2)，即8個基因型峰和4個內參峰。

3.討論

目前常用的SNP檢測方法：qPCR法的優點是靈敏度高、準確性強，其缺點是通量低且探針成本高;DNA芯片有高通量等優點，其缺點為成本昂貴、靈敏度低、重復性差且準確性低;Sanger測序法是SNP分析金標準，能發現已知SNP和未知SNP，缺點是工作量大，周期長，多位點檢測累計價格相對昂貴。

本研究提供了一種快速、準確同步檢測多個SNP位點用于指導華法林用藥指導的新方法。目前，國內外尚無類似的研究報道。

［1］Santos PC，et al.CYP2C9 and VKORC1 polymorphisms influence warfarin dose variability in patients on long-term anticoagulation.Eur J Clin Pharmacol.2013 Apr;69(4)：789-97.

［2］Carlquist JF，et al.Genotypes of the cytochrome p450 isoform，CYP2C9，and the vitamin K epoxide reductase complex subunit 1 conjointly determine stable warfarin dose：a prospective study.J Thromb Thrombolysis.2006 Dec;22(3)：191-7.

［3］Hamberg AK，et al.Characterizing variability in warfarin dose requirements in children using modelling and simulation.Br J Clin Pharmacol.2014 Jul;78(1)：158-69.

［4］Voora D，et al.A polymorphism in the VKORC1 regulator calumenin predicts higher warfarin dose requirements in African Americans.Clin Pharmacol Ther.2010 Apr;87(4)：445-51.

［5］King CR，et al.Gamma-glutamyl carboxylase and its influence on warfarin dose.Thromb Haemost.2010 Oct;104(4)：750-4.

R452

B

1009-6019(2015)03-0060-02

卓永，(1963-11-)，男，大專，江蘇睢寧，主治醫師