不同劑量阿托伐他汀對糖尿病合并冠心病患者外周血單個核細胞NF-κB活性的影響

黃改榮，張倩，段明勤，徐先靜，曹選超，桑甜甜

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論著·臨床

不同劑量阿托伐他汀對糖尿病合并冠心病患者外周血單個核細胞NF-κB活性的影響

黃改榮，張倩，段明勤，徐先靜，曹選超，桑甜甜

目的 探討阿托伐他汀對糖尿病合并冠心病患者外周血單個核細胞NF-κB活性的影響。方法 150例患者根據CAG結果及臨床病史分為對照組(A組)30例、冠心病組(B組)60例、糖尿病合并冠心病組(C組)60例，再將B組和C組按數字表法隨機分為他汀10 mg亞組和 40 mg亞組各30例，采用酶聯免疫吸附法、乳膠增強透射免疫比濁法和流式細胞儀方法檢測各組患者治療前后外周血白細胞介素-6(IL-6)、高敏C反應蛋白(hs-CRP)水平和單個核細胞NF-κB活性。結果 (1)與A組比較，B組和C組外周血單個核細胞NF-κB及IL-6、hs-CRP水平活性均不同程度升高，他汀治療后NF-κB活性及IL-6、hs-CRP水平下降，且他汀40 mg亞組較他汀10 mg亞組下降更顯著(P<0.05或P<0.01)；(2)患者單個核細胞NF-κB活性與外周血IL-6、hs-CRP水平呈正相關(r=0.550，0.675，P<0.01)。結論 糖尿病合并冠心病患者外周血單個核細胞NF-κB明顯激活，高劑量他汀可顯著抑制體內炎性反應。

冠心?。惶悄虿。患毎艘蜃应蔅；阿托伐他汀

冠心病和糖尿病是2種高發病、常見病，且研究發現糖尿病是冠心病的重要危險因素及等危癥，高達55%的糖尿病患者并發冠心病[1]。針對上述現象多數專家學者認為慢性炎性反應在兩者的發生、發展及轉歸中發揮著至關重要作用[2，3]，因此，炎性因子成為目前冠心病和糖尿病的研究熱點。細胞核因子κB(NF-κB)是一種對多種炎性因子基因轉錄都具有多向調控作用的轉錄因子，處于炎性反應的核心位置，具有促炎和抗炎的雙重作用[4，5]。本研究通過比較糖尿病合并冠心病患者外周血白細胞介素-6(IL-6)、高敏C反應蛋白(hs-CRP)水平和單個核細胞NF-κB活性，高低劑量阿托伐他汀組治療前后IL-6、hs-CRP水平和NF-κB活性變化，為相關疾病的臨床治療及療效判斷提供新的依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2011年7月—2013年3月在河南省人民醫院行選擇性冠狀動脈造影術(CAG)的患者150例，根據CAG結果及臨床病史分為：對照組(A組)30例，CAG結果排除冠心病，且無糖尿病；冠心病組(B組)60例，有典型的心絞痛癥狀，且CAG結果提示至少有1支冠狀動脈血管病變≥50%，除外糖尿病診斷；糖尿病合并冠心病組(C組)60例，除CAG結果滿足冠心病診斷外，根據“中國2型糖尿病防治指南(2010年版)”[6]診斷為2型糖尿病。所有患者均需排除患有嚴重的外周動脈粥樣硬化疾病、急性心力衰竭、血栓栓塞性疾病、自身免疫系統疾病、急慢性感染、近3個月內手術及創傷、嚴重的肝腎功能不全、惡性腫瘤和1個月內服用抗炎及調脂藥物者。B組和C組患者按數字表法隨機分為高劑量及低劑量2個亞組，每組各為30例。本研究經院醫學倫理委員會批準，所有入組者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 干預方法 B組和C組2個亞組分別給予阿托伐他汀(立普妥，輝瑞制藥有限公司生產)10 mg/d和40 mg/d，每晚1次，并給予相同劑量的阿司匹林、氯吡格雷、硝酸酯類及β受體阻滯劑，治療1個月。

1.3 觀察指標與方法 (1)一般情況的收集: 入院后詳細記錄患者性別、年齡、身高、體質量及吸煙史、高血壓病、肝腎疾病及代謝性疾病等病史，計算體質量指數(BMI)。(2)血脂、血糖檢測：入院次日及服用阿托伐他汀1個月后晨起空腹抽取肘靜脈血，并采用日本日立公司7060型全自動生化分析儀測定TG、TC、LDL-C、空腹血糖(FPG)。(3)外周血單個核細胞NF-κB活性檢測：入院次日及服用阿托伐他汀1月后抽取肘靜脈血使用流式細胞儀法檢測。步驟如下： ①制備單個核細胞懸浮液：取50 μl經EDTA抗凝處理的血標本，加入2 ml溶血素，搖勻后室溫靜置25～30 min，2 000 r/min離心5 min，共2次，棄上清，加1 ml PBS液，搖勻后加150 μl A液，靜置10 min后加入100 μl B液，靜置10 min后重復上述步驟一遍。②染色：向上述制備好的單個核細胞懸液中加入0.2 ml PBS液，調整細胞數為1.0×106/ml，吸取約10 μl細胞懸液置于載玻片一端，Wright-Giemsa染色1次，顯微鏡下觀察判斷懸液制備是否成功。③檢測：直接向單個核細胞懸液中加1∶100鹽水稀釋的NF-κB p65McAb(美國Santa Cruz公司)，室溫靜置1h后加入40 μl FITC標記的IgG(1∶100鹽水稀釋)，室溫下靜置45 min，再加20 μl PI液，暗室內靜置30 min。采用流式細胞儀(美國BectonE Dickinson公司，FACS400型)檢測NF-κB活性。(4)IL-6、hs-CRP水平檢測：入院次日及服用阿托伐他汀1月后晨起空腹抽取肘靜脈血分別采用酶聯免疫吸附法和乳膠增強透射免疫比濁法檢測。

2 結 果

2.1 一般情況及血脂、血糖比較 各組患者性別、年齡、BMI、吸煙比率、患高血壓比率和TC、TG、LDL-C水平比較差異均無統計學意義(P>0.05)； B組他汀10 mg和40 mg亞組FPG與A組比較差異均無統計學意義(P>0.05)，C組他汀10 mg和40 mg亞組 FPG與A組和B組各亞組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 各組治療前后單個核細胞NF-κB活性比較 阿托伐他汀治療前，B組和C組各亞組患者單個核細胞NF-κB活性較A組明顯升高(tB=12.18、11.11，tC=16.30、14.39，P<0.01)，且C組各亞組患者NF-κB活性較B組各亞組亦明顯升高(t=4.12、3.27，P<0.01)，但C組、B組他汀10 mg和40 mg亞組之間NF-κB表達活性差異無統計學意義(tB=1.06，tC=1.91，P>0.05)。阿托伐他汀治療后，B組和C組各亞組患者單個核細胞NF-κB活性較治療前明顯下降(t=2.83、4.54、6.50、10.37，P<0.01)，且B組和C組他汀40 mg亞組患者單個核細胞NF-κB活性下降明顯高于他汀10 mg亞組(t=2.24,P<0.05，t=2.70,P<0.01)。見表2。

表1 各組患者一般情況與常規生化結果

注：與A、B組比較，aP<0.05

表2 他汀治療前后細胞NF-κB活性比較

注：與A組比較，aP<0.01；與B組同劑量亞組比較，bP<0.01；與同組他汀10 mg亞組比較，cP<0.05，dP<0.01

2.3 各組治療前后IL-6、hs-CRP比較 阿托伐他汀治療前，B組和C組患者IL-6、hs-CRP較A組明顯升高(tB=7.49、7.93、18.79、27.78；tC=12.28、11.57、27.78、28.67，P<0.01)，且C組患者IL-6、hs-CRP較B組亦明顯升高(t=4.79、3.64，12.00、11.02，P<0.01)，但C組、B組他汀10 mg和40 mg亞組之間IL-6、hs-CRP差異無統計學意義(tB=0.45、1.87，tC=0.71、0.89，P>0.05)。阿托伐他汀治療后，B組和C組患者IL-6、hs-CRP較治療前明顯下降(t=31.97、30.32、31.64、34.33、24.25、29.16、23.72、27.17，P<0.01)，且B組和C組他汀40 mg亞組IL-6、hs-CRP下降值明顯高于10 mg亞組(t=4.88、5.95、6.62、5.12，P<0.01)。見表3。

表3 他汀治療前后IL-6、hs-CRP比較

注：與A組比較，aP<0.01；與B組同劑量亞組比較，bP<0.01；與同組治療前比較，cP<0.01；與同組他汀10 mg亞組比較，dP<0.01

2.4 單個核細胞NF-κB活性與IL-6、hs-CRP的相關性 患者單個核細胞NF-κB活性與IL-6、hs-CRP呈正相關(r=0.550、0.675，P<0.01)。

3 討 論

流行病學研究表明，冠心病和糖尿病是中老年患者中的2種高發病、常見病，冠心病以動脈粥樣硬化(AS)為病理基礎，糖尿病以血糖代謝紊亂為主要特征。目前研究發現糖代謝異常可導致全身多種器官組織病變，尤其與心腦血管慢性損傷和功能障礙密切相關，糖尿病患者合并冠心病的比率明顯高于非糖尿病患者，且冠狀動脈病變彌漫、嚴重，病情進展迅速，認為糖尿病是冠心病的重要危險因素及等危癥[1，7]。我們前期的研究結果也證實急性冠狀動脈綜合征患者及穩定型心絞痛患者合并糖尿病比率顯著高于對照組患者[8]。研究證實NF-κB及其靶基因的轉錄產物TNF、IL-1和IL-6在2型糖尿病胰島素抵抗的發生及發展中發揮著重要作用，但具體機制還有待進一步研究[9]。近年來相關研究提示在冠心病病理基礎動脈硬化的發生、發展，甚至急性冠狀動脈事件存在明顯的炎性反應，因此處于炎性反應調控關鍵位置的NF-κB成為相關領域的研究熱點[10]。因此多數專家學者認為慢性炎性反應是聯系冠心病與糖尿病發生、發展及轉歸的樞紐，是兩者的共同作用機制[2，3]。目前研究發現血清高遷移率族蛋白(HMGB1)是穩定型心絞痛患者存在不穩定斑塊的獨立危險因子[11]，并通過激活MAPKs途徑及下游NF-κB促發炎性反應，誘導IL-1、IL-6、TNF-α和CRP等炎性因子在斑塊周圍聚集進一步加重炎性反應[12]。作為一種炎性反應因子，IL-6可激活內皮細胞和白細胞，參與冠狀動脈粥樣硬化斑塊的形成與破裂等過程[13]。hs-CRP亦具有直接促進炎性反應和動脈粥樣硬化的作用，可改變斑塊結構，促使斑塊破裂，在臨床上已經普遍用于冠心病炎性反應的檢測[14]。

Sen和Baltimore于1986年首次發現NF-κB，是一種核轉錄因子，能與免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強子序列特異性結合[15，16]。NF-κB通過調節白介素、TNF、細胞黏附分子、IFN等表達參與包括免疫反應、炎性反應、增殖、腫瘤和細胞凋亡等生理、病理過程，且處于上述過程的關鍵位置[17]。本研究結果提示冠心病及糖尿病合并冠心病患者單個核細胞NF-κB活性明顯高于對照組，且糖尿病合并冠心病患者高于冠心病患者，結果與相關文獻報道相符。

阿托伐他汀是HMG-CoA還原酶抑制劑，除可阻斷膽固醇合成外還具有重要的多效性,如改善內皮細胞功能、抗炎、抑制平滑肌增殖、抗氧化和穩定斑塊[18，19]。研究發現他汀可以顯著改善冠心病患者的動脈僵硬度[20，21]，瑞舒伐他汀可降低高hs-CRP患者主要心血管事件和各種原因死亡的發生率[22]，但Nakata等[23]研究卻發現阿托伐他汀可誘導NF-κB激活和神經元型一氧化氮合酶(nNOS)的應答,表現出促炎性作用，因此他汀對心血管疾病的總體作用尚待進一步的研究。本研究結果提示阿托伐他汀治療后冠心病及糖尿病合并冠心病患者單個核細胞NF-κB活性明顯下降，IL-6、hs-CRP等炎性因子水平亦明顯下降，且糖尿病合并冠心病患者下降較冠心病患者顯著，阿托伐他汀40 mg亞組患者治療效果優于阿托伐他汀10 mg亞組患者。提示阿托伐他汀可通過抑制單個核細胞NF-κB活性減輕冠心病及糖尿病患者體內的炎性反應，且高劑量組他汀治療效果優于低劑量組。

綜上所述，糖尿病合并冠心病患者存在高水平的炎性反應，給予高劑量他汀可顯著抑制單個核細胞NF-κB激活，降低IL-6、hs-CRP水平，減輕炎性反應，且NF-κB可同hs-CRP一樣作為治療效果判斷指標之一。但有關單個核細胞NF-κB活性與他汀治療時間變化趨勢及遠期效果尚待進一步研究。

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《疑難病雜志》述評欄目征稿

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Effect of atorvastain on nuclear factor kappa B activity in patients with diabetes mellitus combined coronary heart disease

HUANGGairong,ZHANGQian,DUANMingqin,XUXianjing,CAOXuanchao,SANGTiantian.DepartmentofCardiology(elderly),HenanPeople’sHospital,Zhengzhou450003,China

Correspondingauthor:ZHANGQian,E-mail:fantasyzq@163.com

Objective To investigate the effect of atorvastain on nuclear factor kappa B activity in patients with diabetes mellitus (DM) combined coronary heart disease (CHD).Methods There were one hundred and fifty patients, thirty of them were divided into control group (group A), sixty of them were divided into coronary heart disease group (group B), and the last sixty of them were divided into diabetes mellitus combined coronary heart disease group (group C). The patients of group C and group B were randomly divided into two subgroups: 10 mg of atorvastatin group and 40 mg of atorvastatin group. The activity of nuclear factor kappa B and level of IL-6, hs-CRP were tested by flow cytometry method, enzyme linked immunosorbent method and latex enhanced transmission cells immune turbidimetric method. Results (1) Compared with group A, the level of IL-6, hs-CRP and activity of NF-κB in group B and group C were increased. After treated with atorvastain,the level of IL-6,hs-CRP and activity of NF-κB were decreased,and 40mg atorvastain subgroup declined more significantly (P<0.05 orP<0.01). (2) There was positive correlation between NF-κB and IL-6, and between NF-κB and hs CRP (r=0.550,r=0.675,P<0.01).Conclusion The activity of NF-κB in patients with diabetes mellitus and coronary heart di-sease was higher, being treated with high dose of atorvastatin can significantly inhibit the inflammatory response in vivo.

Coronary heart disease; Diabetes mellitus; Nuclear factor Kappa B; Atorvastain

河南省科技攻關項目(No.092102310065)

450003 鄭州，河南省人民醫院康馨綜合科

張倩，E-mail:fantasyzq@163.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2015.05.001

2015-01-14)