miR-25/TWIST1調控通路在成骨細胞礦化中的作用研究

楊麗，趙新蘭，唐卓，陳凱，秦愛平

論著·基礎

miR-25/TWIST1調控通路在成骨細胞礦化中的作用研究

楊麗，趙新蘭，唐卓，陳凱，秦愛平

目的 探究miR-25在成骨細胞分化過程中的作用及其作用機制。方法 β-甘油磷酸(β-glycerophosphate，β-GP)和抗壞血酸(ascorbic acid)誘導成骨細胞礦化，茜素紅(Alizarin Red S)染色實驗觀察成骨細胞的礦化情況。生物信息學運算預測miR-25的靶基因。實時定量PCR法檢測miR-25以及其他相關基因的表達。過表達實驗和抑制實驗用于研究miR-25在成骨細胞分化中的作用及其與靶基因之間的相互關系。熒光素酶報告基因實驗驗證miR-25與其靶基因之間的結合。結果 miR-25的表達隨成骨分化過程而逐漸升高。過表達miR-25通過轉錄后調控其靶基因TWIST1的表達來促進成骨分化。作為調控成骨細胞分化的的轉錄因子，扭曲基礎螺旋—環—螺旋蛋白1(TWIST1)是miR-25的靶基因。結論 miR-125通過作用于靶基因 TWIST1在成骨細胞的分化中發揮了重要的調控作用，表明調控miR-25的表達,可能成為骨代謝疾病新的治療靶點。

microRNA; 成骨細胞分化; 轉錄因子；靶基因

成骨細胞和破骨細胞的活性形成了骨重建和骨吸收，二者間的動態平衡維持了骨量的相對穩定。成骨細胞是由原始成骨細胞分化成熟而來的骨形成細胞。多種骨代謝疾病如骨質疏松癥或骨形態、骨結構和骨功能的病理狀態與成骨細胞的礦化異常密切相關[1]。成骨細胞的礦化過程牽涉了成骨細胞與其他細胞間的相互作用，而這一相互作用過程是受到多個細胞因子調控的復雜過程[2]。miRNA可與靶mRNAs的3’非翻譯區(3’UTRs)或編碼區序列(CDS)以不完全互補配對的方式結合后[3]，通過抑制其翻譯或促使mRNA分子降解的方式參與調控靶基因的表達[4]。

最近有關miRNAs和骨代謝的研究逐漸被人們所重視。然而miR-25在成骨細胞礦化過程中的作用及其機制尚需進一步研究。本研究分析miR-25在成骨細胞分化中的表達模式并揭示miR-25在β-甘油磷酸鈉(β-GP) + 抗壞血酸(ascorbic acid ,AA)誘導的成骨細胞分化過程中的調控作用及其機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)細胞：新生小鼠乳鼠顱骨的成骨細胞。(2)主要儀器：Nikon 300型自動攝像倒置顯微鏡(日本Nikon公司)，電泳儀、轉印儀、紫外交聯儀、凝膠成像系統(美國Bio．Rad公司)，流式細胞儀(美國Coulter公司)。(3)主要試劑：無酚紅α-MEM培養液、Trizol以及胎牛血清(FBS)(美國Gibico公司)，0．25%胰酶-EDTA、膠原酶(美國Gibico公司)，β-GP(美國Invitrogen公司)，AA(美國Sigma公司)，茜素紅染色試劑盒(美國Sigma公司), anti-miR-25(GenePharma Co., Ltd),扭曲基礎螺旋—環—螺旋蛋白1(TWIST1) siRNA(OriGene Technologies Inc)。

1.2 方法

1.2.1 原始成骨細胞的培養：遵照南華大學附屬湖南省老年醫院倫理委員會議程用手術、酶消化法分離新生小鼠乳鼠顱骨的成骨細胞。含100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的α-MEM培養液吹打均勻后接種于培養皿中，37°C, 5% CO2培養，每2～3天換液1次，至細胞鋪滿80%培養皿底時以0.25%胰酶消化傳代。 使用誘導培養液(含50 mg/L AA、10 mmol/L β-GP)誘導成骨細胞礦化。茜素紅染色法鑒定成骨細胞礦化成熟，并檢測TWIST1的mRNA及蛋白表達水平。

在AA和β-GP誘導成骨細胞(OBs)分化的第0天、7天、14天和21天分別用Western Blot法、PCR法檢測TWIST1蛋白表達水平和miR-25的表達。

1.2.2 實時定量PCR分析：利用羅氏實時熒光定量PCR儀，方法按參考文獻[5]。miR-25和TWIST1分別以 U6和β-actin作為內參，其引物見表1、2。

表1 microRNA實時定量RT-PCR引物序列

表2 mRNA實時定量RT-PCR引物序列

1.2.3 茜素紅染色：茜素紅染色陽性的礦化結節是成骨細胞分化、礦化和功能的標志。其步驟如下：培養皿用PBS洗2次，70%乙醇固定1 h，PBS洗5遍。調至pH 4.2, 1%茜素紅染色30 min，加入50%乙醇去除非特異性著色，空氣干燥。隨后倒置顯微鏡下以200倍數觀察茜素紅染色陽性的礦化結節。茜素紅定量的測定參照文獻[6]的方法：加入氯化十六烷基置室溫下30 min。吸取上清，使用紫外分光光度計，波長540 nm處測樣本吸光值A，用氯化十六烷基溶液調零，茜素紅量用ng/mg蛋白表示。每個視野計數重復3次，取平均值。

1.2.4 miR-25靶基因預測：應用TargetScan軟件預測并使用RNA22-HSA進行驗證。

1.2.5 質粒構建與轉染：質粒構建方法按參考文獻[7]，構建包含所預測miR-25結合位點的WT-pGL3-TWIST1-3′UTR。引物如下，F：5′-GGCTCTAGAGTCACCTCAGCGGCCATTC-3′R：5′-GGCCGGCCCCGACAGCCAGTCAAAGA-3′。MUT-pGL3-TRAF6-3′UTR.突變引物如下，F：5′-GACAGCCTTTCCTACTACCAT-3′R：5′-CTTATTCCGTTCCCTTCG-3′

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1.2.6 熒光素酶報告基因實驗：外周血單核細胞與野生型或突變型 pGL3-TWIST1-3′UTR和miR-25或 miR-C共培養48 h。空脂質體作為陰性對照。

雙熒光素酶報告基因系統(Promega)和光度計用以熒光信號定量。每個熒光素酶值通過海腎熒光素酶值進行校正。

2 結 果

2.1 miR-25與TWIST1表達水平的變化 TWIST1在成骨細胞礦化的表達隨時間呈逐步下降趨勢。在礦化的關鍵時間段14～21 d持續處于較低表達水平。miR-25表達在成骨細胞分化過程中逐漸上升，在第0～21 d隨著誘導時間的延續逐漸上升。結果表明miR-25的表達在成骨細胞分化過程中呈現明顯上升趨勢，而TWIST1在成骨細胞礦化的表達呈逐步下降趨勢，提示miR-25可能在成骨細胞分化過程中起到了重要的調控作用，且該作用可能與TWIST1相關。見圖1。

2.2 miR-25對β-GP和AA誘導的成骨細胞分化的影響 與轉染miR-C的對照組比較，轉染pre-miR-25組的茜素紅定量升高約2倍 (P<0.05)，表明過表達miR-25促進了OBs的分化成熟。見圖2。

注：A.TWIST1的表達呈逐步下降趨勢，在礦化的關鍵時間段14～21 d持續處于較低表達水平。B.miR-25的表達呈逐步上升趨勢，在礦化的關鍵時間段14～21 d持續處于較高表達水平

注：Pre-miR-25與對照質粒(pre-miR-C)分別轉染成骨細胞，加入50 mg/l抗壞血酸和10 mmol/L β-甘油磷酸鈉誘導培養14 d后，行茜素紅染色。與對照組比較，aP<0.05

2.3 miR-25對TWIST1的作用 利用TargetScan軟件預測miR-25的靶基因。在TWIST1的3′UTR區存在miR-25的堿基互補序列(圖3A)。 將miR-25表達載體(pre-miR-25)轉染至OBs并用β-GP 和AA誘導其分化。結果顯示，與對照組相比，轉染miR-25表達載體組的miR-25的表達明顯升高至2倍。這表明miR-25表達載體構建成功(圖3B)。 pre-miR-25轉染OBs 48 h后實驗結果表明，過表達miR-25降低了TWIST1的蛋白表達水平，而過表達miR-25的表達對成骨細胞分化相關的其他一些關鍵基因如：SMAD5、EPAH4 沒有直接作用，而TWIST1的mRNA水平無明顯改變(圖3C)。

將WT-pGL3-TWIST1-3’UTR或MUT-pGL3-TWIST1-3′UTR與pre-miR-25或miR-C共轉染OBs。結果示，與共轉染miR-C或MUT-pGL3-TWIST1-3′UTR相比，當WT-pGL3-TWIST1-3′UTR與miR-25共轉染時，miR-25結合于TWIST1 mRNA的3’UTR端致熒光素酶活性受到明顯抑制，而對照組熒光素酶活性則無明顯改變(圖3D)。結果表明miR-25結合于TWIST1的3’UTR，且TWIST1是miR-25的靶基因。

注：A.圖示TWIST1的3’UTR端存在miR-25的結合位點，且標注了野生型(WT)TWIST1-3’UTR以及突變型(MUT)TWIST1-3’UTR。B. PCR實驗驗證miR-25過表達與抑制表達載體構建成功，與對照組比較，aP<0.05。C.miR-25在轉錄后水平抑制TWIST1的表達。過表達miR-25的表達對成骨細胞分化相關的其他一些關鍵基因如：SMAD5、EPAH4 沒有直接作用。與對照組比較，aP<0.05。D.熒光素酶報告基因實驗示：共轉染pre-miR-25可以降低野生型(WT)TWIST1-3’UTR的熒光素酶活性而不影響突變型(MUT)TWIST1-3’UTR的熒光素酶活性

圖3 miR-25直接作用于其靶基因TWIST1

3 討 論

在本研究中我們發現，miR-25參與調控了由β-GP和AA誘導的OBs的礦化過程，并且發現了miR-25通過作用于其靶基因 TWIST1發揮其在成骨細胞分化過程中的調控。

miRNAs在轉錄后水平對基因表達的調控發揮了重要作用。本研究發現OBs的成熟礦化過程中miR-25的表達明顯升高。在本研究中，我們選取miR-25作為研究對象并進一步研究其在成骨細胞礦化過程中的作用及其機制。

本研究發現過表達miR-25促進了礦化結節的生成同時抑制了TWIST1的蛋白表達。抑制miR-25則減少了礦化結節的生成同時促進了TWIST1的蛋白表達。表明miR-25在成骨細胞的分化過程中起到了重要的調控作用。我們對miR-25在破骨細胞的分化過程中的調控機制進行了研究。 研究已發現miRNAs通過與靶基因的3’UTR結合來抑制靶基因的轉錄或降低靶基因mRNA的穩定性。我們利用TargetScan軟件預測發現TWIST1是預測的靶基因之一。結果提示miR-25通過與 TWIST1 mRNA的3’UTR結合來調控成骨細胞的分化。 TWIST1 已被發現并證實作用于成骨細胞的礦化過程[8]，并且有文獻已證實TWIST1可以與Runt相關基因2(RunX2)直接作用，來調控成骨相關基因的表達。TWIST1和 RunX2之間的直接相互作用抑制了成骨前體細胞活化后所產生的RunX2與DNA的結合作用[9]。TWIST1可能以類似于神經原質蛋白阻斷Smad1錄復合物與神經膠質分化相關基因的結合的方式影響了骨形態發生蛋白(BMP)在間充質細胞向成骨細胞的分化過程中的作用[10]。另有實驗證實在成骨細胞的分化過程中過表達TWIST1可降低骨鈣素和骨橋蛋白的表達，而骨鈣素和骨橋蛋白是成骨細胞礦化的重要相關基因[11]。

本研究證實miR-25通過作用于靶基因 TWIST1調控成骨細胞分化。熒光素酶報告基因實驗顯示，過表達miR-25可抑制野生型 TWIST1熒光素酶報告基因活性，而突變型TWIST1熒光素酶報告基因載體可取消該作用。另外，過表達和抑制試驗表明miR-25在轉錄后水平抑制 TWIST1的表達水平。而對其他一些可能對成骨細胞分化其調控作用的基因例如：SMAD7和 EPHA4的表達沒有影響。這些結果提示miR-25在轉錄后水平抑制 TWIST1基因的表達。

本研究數據可以得出miR-25的作用模式。成骨細胞分化信號在原始成骨細胞激活礦化結節形成的通路，miR-25表達的升高抑制了 TWIST1的蛋白表達并維持了成骨細胞礦化過程。因此，一個新的miR-25/ TWIST1調控通路被挖掘出來。

綜上所述，本研究證實了miR-25通過一個新發現的miR-25/ TWIST1調控通路參與成骨細胞的礦化調節，為miRNA在成骨細胞分化中的作用提供了新的認識，揭示了miR-25在成骨細胞分化過程中的重要作用并使miR-25表達的調控,可能成為治療骨代謝疾病的新手段。

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Study on the role of miR-25/TWIST1 regulatory pathway in osteoblast mineralization

YANGLi,ZHAOXinlan,TANGZhuo,CHENKai,QINAiping.DepartmentofEndocrinology,HunanProvinceGeriatricHospital,Changsha410001,China

Correspondingauthor:QINAiping,E-mail:244652700@qq.com

【Abstrast】 Objective To explore the role of miR-25 in the process of osteoblast differentiation and its mechanism.Methods β-glycerophosphate (β glycerophosphate, β-GP) and ascorbic acid (ascorbic acid) induced osteoblast mineralization, Alizarin Red (Alizarin Red S) experiment were performed to observe stained cells into bone mineralization. Bioinformatics computing predicted target genes of miR-25. Real-time quantitative PCR was used to detect the expression of miR-25 and other related genes. Overexpression experiments and inhibitions experiments were used to investigate the relationship between of miR-25 in osteoblast differentiation and its relationship with target gene. Luciferase gene reporter experiments were used to demonstrate miR-25 binding to its target genes.Results The expression of miR-25 increased gradually in the process of osteogenic differentiation. Overexpression of miR-25 promotes osteogenic differentiation through post transcriptional regulate TWIST1 expression of its target genes . As a transcription factor that regulates the differentiation of bone cells ,TWIST1 is a target gene of miR-25.Conclusion miR-25 plays an important role in the differentiation of osteoblasts by acting on target gene TWIST1, which indicates that the expression of miR-25 may be a new therapeutic target for bone metabolism.

microRNA; Osteoblast differentiation; Transcription factor; Target gene

湖南省自然科學基金(No.13JJ4119)，湖南省保健專項資金(No.A2014-02)

410016 長沙，湖南省馬王堆醫院老年內分泌科

秦愛平，E-mail:244652700@qq.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2015.11.024

2015-05-16)