慢性乙型肝炎患者呼出氣體的電噴霧萃取電離質譜分析

王海東等

摘 要 應用電噴霧萃取電離質譜法對慢性乙型肝炎患者（41例）及正常人（34例）的呼出氣體樣本進行檢測，迅速獲得其一級質譜指紋譜圖，采用化學計量學方法主成分分析（PCA）和聚類分析（CA）對所獲得的一級質譜數據進行處理后，可有效區分患者與正常人群，且不同臨床類型慢性乙肝聚類分析圖譜有不同表現，此結果有助于慢性乙型肝炎的臨床診斷和病情分析。另外，本方法也為發展簡單、快速、非侵入性慢性乙型肝炎臨床診斷方法提供解決思路。

關鍵詞 慢性乙型肝炎； 呼出氣體； 電噴霧萃取電離質譜； 主成分分析； 聚類分析

1 引 言

肝臟是人體內最大的消化腺，也是體內解毒和新陳代謝的中心。肝臟疾病有著高發病率和死亡率，病因復雜多樣，臨床可表現從無癥狀至嚴重的肝功能衰竭[1]。臨床醫師很早就發現，肝昏迷的患者呼出氣中就有一種肝臭氣味。隨著現代科學技術的發展，特別是分析化學和質譜技術的發展，呼出氣體檢測作為一種了解人體生理代謝過程和疾病狀況的方法備受關注[2，3]。呼出氣與常規的血液檢測方法相比，檢測的最大優點是采樣簡單，具有非侵入性，且樣本連續可得[4]。目前，對呼出氣研究多集中在肺部疾病和環境氣體，肝病的呼出氣研究鮮有報道。

常規的呼出氣檢測質譜方法為氣相色譜質譜聯用（GCMS）法，而此方法需經過復雜的前處理及色譜分離過程，難以滿足臨床診斷的快速分析。電噴霧萃取電離質譜（EESIMS）是一種新型的直接質譜分析方法，可在無需樣品預處理條件下對復雜基體樣品進行直接、快速、靈敏、高通量質譜檢測[5，6]。與其它質譜技術相比較，EESIMS可直接檢測患者呼出氣體，且靈敏度高、響應速度快，能夠實現呼出氣體中的痕量有機物的原位、實時、在線的分析[6＼] 。

本研究利用電噴霧萃取電離質譜（EESIMS）技術對41例慢性乙型肝炎患者呼出氣進行了初步分析，結合化學計量學對所獲得的指紋圖譜對數據進行處理，結果表明，EESIMS結合化學計量學算法僅依靠一級譜圖即可對慢性乙型肝炎患者及正常人的呼出氣體樣本進行較好區分，故而對疾病的診斷和病情的判斷均有一定的臨床意義。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

EESI 離子源[7，8]（東華理工大學研制）；LTQXL 增強型線性離子阱質譜儀（美國Finnigan 公司），配有Xcalibur 數據系統；T2PV/L 型 5L Tedlar采樣袋（大連德霖氣體包裝有限公司）；甲醇（色譜純，SK Chemicals 公司）。

2.2 實驗方法

Tedlar采樣袋在使用前用氮氣清洗3次，每次30 min， 烘干以除去可能殘留的吸附物。受試者夜間禁食、禁煙、禁酒，晨起后勿刷牙，在通風條件良好的環境下呼吸30 min以上，在安靜狀態下向5LTedlar采樣袋內呼氣，直至氣袋充滿為止，同時收集周圍空氣作為實驗背景空白。呼氣樣本收集完畢后利用EESIMS在3 h內完成所有樣本的檢測分析。

2.3 實驗條件

EESIMS分析條件：EESI離子源角度（α，β）和距離（a，b）根據以往文獻＼[7，8＼]優化調節，質譜采用正離子檢測模式，霧化氣（N2）壓力為1.2 MPa；進樣口溫度為100℃，掃描質量范圍50～800 Da；噴霧電壓為3. 5 kV；萃取劑甲醇溶液流速為5 μL/min。

3 結果與討論

3.1 41例慢性乙型肝炎患者與正常人呼出氣體的質譜分析

采用正離子掃描模式，在優化的EESIMS條件下對肝病患者和健康對照組呼出氣體樣本進行快速質譜分析，可以得到其一級質譜指紋譜圖（圖1）。從圖1可知，41例患者同對照組呼出氣體樣本在m/z 50～400范圍內具有豐富的物質信息，表明EESIMS能夠同時檢測到呼出氣體中的多種組分。雖然質譜圖在m/z>400處的質譜信號相對較低，但將指紋圖譜放大20倍后仍可獲得信噪比較高（S/N>10）的質譜。由于呼出氣體中的揮發性標志物含量都較低，所以在一級質譜圖中患者與正常人的主要質譜峰基本相同。但是，仔細觀測這些質譜峰信號后可以發現仍然差別，主要體現在m/z 56， 74， 89， 105， 157， 201， 279， 318等質譜信號。為了更好地區分患者與正常人的呼出氣體的差異，本研究采用化學計量學方法對質譜信號進行統計學處理。

3.3 慢性乙肝不同臨床類型患者的聚類分析

聚類分析（CA）是一種靜態數據分析的統計學方法，它能夠將子集之間更細微的區別與聯系以譜系圖的方式直觀地表現出來，目前已廣泛應用于模式識別和圖像分析等領域[17]。本實驗將已進行過PCA分析的慢性乙型肝炎患者與正常人呼出氣體樣本一級質譜數據導入Matlab軟件自帶的聚類分析程序中進行分析，分析結果如圖4所示。慢性乙肝患者呼出氣體樣本為41個，正常人呼出氣體樣本為34個，從分析結果可知，1～102號樣本點（正常人的呼出氣體）經軟件程序分析后自聚成一類，103～225號樣本點（慢性乙型肝炎患者的呼出氣體）自聚成另一類，從而說明聚類分析能夠明顯的對慢性乙型肝炎患者及正常人的呼出氣體樣本進行區分，這與PCA 的分析結果相印證。而在慢性乙型肝炎患者呼出氣體樣本中，又可明顯看到其一大類中又自聚成4個亞類，分析其可能原因為，103～171號樣本點的23例患者為慢性重型或重度肝炎，病情重，病情進展較快，并發癥較多，短期內發展成為肝衰竭；172～189號樣本點的6例患者診斷為肝硬化，病程長至數月，患者就診時多已出現腹水，處于肝硬化失代償期；190～204號的5例患者來說起病較緩，病情相對較輕，結合生化檢查診斷為慢性中度乙型病毒性肝炎；205～225號的7例患者為慢性輕度乙型病毒性肝炎，臨床表現為食欲下降，睡眠不佳等，癥狀不明顯，生化檢查僅1～2項輕度異常；從慢性乙型肝炎的不同類型之間，因為肝臟的損傷程度不同，而對所測到的物質的代謝也有區別，表現形式不同，符合慢性乙型肝炎的病理生理過程。因此可能成為它們自聚成一類的原因；而本實驗在PCA分析中未發現此差異，說明CA分析能夠直觀地表現出子集之間更細微的差別與聯系。

4 結 論

綜上所述，利用EESIMS對慢性乙型肝炎患者及正常人呼出氣體樣本進行直接質譜分析，獲得其一級質譜指紋譜圖，結合化學計量學中主成分分析法（PCA）和聚類分析法（CA）對所獲得的指紋圖譜數據進行處理，僅一級譜圖即可將慢性乙型肝炎患者及正常人的呼出氣體樣本快速、靈敏、準確地區分開來，且對于臨床不同類型慢性乙型肝炎輕和重也有區別。這個結果對于慢性乙型肝炎的臨床診斷和病情分析有一定的幫助，此方法也為簡單、快速、非侵入性臨床診斷方法的開發提供一種思路。但本研究樣本量較少，部分區別的物質還未能確定，還需進一步深入的研究。

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