CYP17基因多態性與新疆維、漢民族女性乳腺癌相關性研究

李 靜 郭 莉 李 妍 胡 欣 李紅玉 楊順娥

CYP17基因多態性與新疆維、漢民族女性乳腺癌相關性研究

李 靜 郭 莉 李 妍 胡 欣 李紅玉 楊順娥

目的探討CYP17 rs743572位點基因多態性在新疆維、漢民族女性乳腺癌中的分布與乳腺癌易感性的關系。方法應用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)檢測130例維吾爾族女性乳腺癌患者、125例維吾爾族正常女性及120例漢族女性乳腺癌患者、118例漢族正常女性的CYP17 rs743572位點多態性，并分析該位點多態性與新疆維、漢民族女性乳腺癌易感性的關系。結果在病例組及對照組中，維、漢兩民族基因型分布及等位基因頻率具有顯著差異(P<0.05)；在維、漢族各亞組中，病例組與對照組的基因型分布差異及等位基因頻率均無統計學差異(P>0.05)；維、漢兩民族病例組與對照組各基因型及等位基因均未增加患乳腺癌的風險。結論病例組、對照組中維、漢兩民族基因型分布及等位基因頻率具有顯著差異。CYP17基因rs743572位點多態性與新疆維、漢民族女性乳腺癌的發生無明顯相關。

乳腺癌；CYP17基因；維吾爾族；漢族；基因多態性

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:1588～1592)

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一[1]，其發生發展存在著顯著的種族及地域的差異。日益增多的研究表明，乳腺癌相關基因的單核苷酸多態性為不同種族、不同人群乳腺癌發生差異的根本原因[2]。而由于乳腺癌為雌激素依賴性腫瘤，故與雌激素合成代謝相關的基因突變最有可能會改變雌激素的暴露情況，從而影響乳腺癌的發生發展。CYP17基因是參與雌激素合成代謝的關鍵酶，在其5'編碼區存在著T→C的多態位點[3]，即rs743572多態位點，該多態性位點的存在影響了CYP17基因的轉錄，從而影響了體內雌激素的水平，故與乳腺癌的發生緊切相關。目前關于CYP17基因單核苷酸多態性與維吾爾族乳腺癌的相關性未見報道，本文通過病例-對照研究及Logistic回歸分析，探討了CYP17 rs743572位點基因多態性與新疆維、漢民族女性乳腺癌易感性之間的關系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

病例組需居住在新疆地區20年以上，經術后臨床病理確診為乳腺癌，排除既往有化放療、內分泌治療及腫瘤病史者，需除外合并嚴重臟器功能障礙、懷孕及哺乳期婦女。以體檢健康女性為對照組。維、漢受試者家族中均無異族通婚史。其中，病例組為2013年1月到2014年9月就診于新疆醫科大學附屬腫瘤醫院的130例維吾爾族及125例漢族初診原發性乳腺癌的患者，對照組為三甲綜合性醫院體檢正常的120例維吾爾族及118例漢族健康女性。結果顯示，在維吾爾族中，病例組年齡為24～70歲，平均年齡為(45.35±9.33)歲，對照組年齡為24～66歲，平均年齡為(44.30±9.72)歲，兩組的年齡分布差異無統計學意義(χ2=0.000，P>0.05)；漢族中，病例組年齡為25～73歲，平均年齡為(45.75±8.47)歲，對照組年齡為23～73歲，平均年齡為(44.95±8.44)歲，兩組年齡分布亦無統計學差異(χ2=0.000，P>0.05)。以上研究對象為排除擴增失敗的樣本。本研究經新疆醫科大學醫學倫理委員會審核批準，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 實驗室檢測

1.2.1 材料和試劑 血液基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)購自天根生化科技有限公司(北京)，引物使用NCBI網及引物設計軟件Primer Premier 5設計，由北京奧科鼎盛生物公司合成。Msp I限制性內切酶(10 U/μl)購自Fermentas公司(加拿大)。

1.2.2 實驗方法 抽取維、漢受試者清晨空腹外周靜脈血2 mL，編號標記，裂解紅細胞提取DNA，行對應片段PCR擴增、限制性內切酶酶切、通過電泳觀察圖譜來分析序列之間的差異。CYP17 rs743572位點位于5'啟動子區，存在T-C多態位點。從Genebank中獲取基因序列，引物使用NCBI網及引物設計軟件Primer Premier 5設計，上游引物：5'-CAT TCG CAC TCT GGA GTC-3'；下游引物：5'-AGG CTC TTG GGG TAC TTG-3'，PCR產物419 bp，擴增條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35次循環后72 ℃最終延伸7 min。PCR反應產物經過2%瓊脂糖凝膠100V 恒定電壓下電泳50 min分離，Marker所示條帶由上至下分別為600 bp、500 bp、400 bp、300 bp、200 bp、100 bp共6條條帶，當PCR產物CYP17在419 bp處出現特異性熒光條帶，表示擴增成功。將擴增產物及酶切體系配好于0.2 ml PCR管內，37 ℃酶切12 h，經過3.5%瓊脂糖凝膠80 V電壓下電泳50 min。隨機選取部分CYP17 rs743572基因片段基因型PCR擴增產物進行基因序列的測定。

1.3 統計學分析

應用 SPSS 17.0統計軟件對所得數據進行分析，測得的基因型、等位基因頻率與Hardy-Weinberg平衡的符合程度以及維、漢病例組與對照組之間等位基因與基因型頻率的比較采用卡方檢驗(χ2檢驗)。應用非條件logistic回歸分析計算優勢比(odds ratio,OR)及其95%可信區間(confidence interval，CI)分析CYP17基因rs743572基因多態性與乳腺癌發病的相對危險度，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 擴增DNA檢測結果

采用紫外分光光度法，檢測CYP17樣本基因組DNA，結果顯示，在493個樣本中，平均濃度為567.20 ng/μL，平均吸光值為1.83。

2.2 PCR擴增電泳產物

CYP17 rs743572片段引物擴增后產物為419 bp，在Marker標記中，其位于500 bp和400 bp條帶之間并接近400 bp，有特異性大小的片段產生。如顯影不佳或未顯影時需查找原因并重新進行檢測，見圖1。

M為Marker；1～7為PCR產物。

2.3 酶切結果

未被酶切開的長度419 bp的一條亮帶為TT型，出現295 bp和124 bp兩個條帶的為CC型，出現419 bp、295 bp、124 bp 3個條帶的為TC型，見圖2。

M為Marker;1、2為TT純合子;3、4為CC純合子;5、6為TC雜合子。

2.4 PCR產物測序鑒定

隨機選取的CYP17 3種基因型PCR擴增產物進行基因序列的測定結果如圖顯示，測序結果中堿基的改變與酶切結果一致，見圖3。

A為TT基因型(74T);B為CC基因型(74C);C為TC基因型(74C/T)。

2.5 Hardy-Weinberg平衡檢測

應用SPSS 17.0 軟件進行CYP17各基因型 H-W 平衡的檢測，結果顯示，新疆維吾爾族及漢族的病例組和對照組的CYP17各基因型分布均符合H-W平衡定律，各P值分別為0.876、0.818、0.965、1.000，提示維、漢民族病例組和對照組基因型均符合遺傳平衡定律，見表1、2。

2.6 基因型分布

維吾爾族主要為T等位基因攜帶者，而漢族以C等位基因攜帶者為主。在病例組及對照組中，不同基因型及等位基因頻率在維、漢兩民族中分布的差異均具有統計學意義，χ2值分別為15.864、15.457、9.083、9.201，P<0.05。但在維吾爾族及漢族組中，病例組與對照組基因型分布及等位基因分布差異均無統計學意義(P>0.05)，見表3、4。

表1 維吾爾族病例組和對照組Hardy-Weinberg平衡檢測(例，%)

表2 漢族病例組和對照組Hardy-Weinberg平衡檢測(例，%)

表3 在病例組及對照組中維漢民族基因型分布及等位基因頻率的比較(例，%)

表4 在維漢民族中各基因型分布及等位基因頻率的比較(例，%)

2.7 CYP17基因型多態性與乳腺癌的危險性關系

Logistic 回歸模型分析顯示，以野生型TT基因型為對照，TC、CC或TC+CC基因型均與維吾爾族及漢族女性乳腺癌的發病風險無關(P>0.05)。而與等位基因T相比較，攜帶等位基因C亦與維吾爾族及漢族女性乳腺癌的發病風險無關(P>0.05)，見表5、6。

表5 CYP17各基因型及等位基因型與維吾爾族乳腺癌危險性的關系(例，%)

表6 CYP17各基因型及等位基因型與漢族乳腺癌危險性的關系(例，%)

3 討論

近40年來亞洲女性的乳腺癌發病率呈逐年上升趨勢[4]，新疆維吾爾族乳腺癌患病例數亦呈上升趨勢，而內源性雌激素在乳腺癌的發生發展中起著重要的作用。雌激素參與乳腺癌的發生一方面是通過增加乳腺導管上皮細胞有絲分裂作為促癌因子；另一方面，雌激素代謝產物可與DNA結合，引起DNA損傷和直接導致基因突變作為癌變的啟動因子發揮作用。CYP17是參與雌激素合成代謝的關鍵酶，位于人類染色體10q24.3區域，包括7個內含子和8個外顯子，主要催化其它性激素和類固醇激素形成雄激素前體物質[5]，從而形成雌激素。

目前發現CYP17基因單核苷酸多態性位點主要為以下3處[3]：①在6內含子的5471堿基上存在著一個C→T的突變位點；②在其編碼區5'上游的47堿基處存在G→A的突變位點；③在其5'編碼區的34堿基處有一個T→C的突變位點，即rs743572多態位點，該單核苷酸多態性位點變異為限制性內切酶MspA I的酶切位點，此多態性位點的存在使得CYP17的5'翻譯區出現了一個額外的CCACC啟動子位點，改變了CYP17基因的轉錄，從而影響體內雌激素的水平，故此多態位點研究較多。

目前關于CYP17基因多態性與乳腺癌易感性的相關性研究未取得一致的結論。大部分研究證實C等位基因型與女性循環中高雌激素水平相關，并增加乳腺癌的發病風險[6]，但目前關于CYP17基因單核苷酸多態性與維吾爾族乳腺癌的易感性未見報道。維吾爾族乳腺癌較漢族乳腺癌有其自身的特點，如具有發病年齡小、妊娠次數多、月經初潮晚、絕經年齡小、哺乳時間長、腫瘤負荷大、腋窩淋巴結轉移多、孕激素受體陽性率低、三陰性乳腺癌多[7]等特點。由此提示，遺傳易感性及單核苷酸多態性可能是上述差異的潛在原因之一。Gibson等[8]報道發現亞洲的菲律賓人乳腺癌的患病率較亞洲其他地區人群高，這也進一步揭示了乳腺癌的發病是遺傳與環境因素共同作用的結果。

本研究結果顯示，維、漢兩民族病例組及對照組基因型分布及等位基因頻率具有顯著差異(P<0.05)。維吾爾族含有高加索人種血統，其主要攜帶T等位基因，而漢族作為亞洲人種，其主要攜帶C等位基因，這與既往國內外研究結果一致。而本研究中，維吾爾族及漢族女性乳腺癌患者CC型基因頻率分別15.4%、33.3%，這與美國(16%)、日本(26%)有所差異[9-10]，原因可能與地域環境、研究群體的選擇、各種隨機偏差和系統誤差以及小樣本量等因素有關。

此外，謝偉等[11]對中國漢族女性的相關研究顯示，病例組突變基因型顯著高于對照組(P<0.05)，且突變基因型增加了中國漢族女性的乳腺癌的發生風險。Anna等[12]對波蘭羅茲地區高加索人的研究亦提示CC基因型及攜帶突變C等位基因可能增加乳腺癌的發生風險。然而王麗等[13]在一份大宗的Meta分析中指出，無論CYP17基因純合突變還是雜合突變模型與女性乳腺癌的易感性均無關(P>0.05)，但該研究包含高加索人及漢族，沒有具體分析不同民族之間的差異，故可能對Meta分析的結果有一定的影響。另一項針對高加索人種的大型薈萃分析[14]中，共納入35項研究包括22 090例病例和28 498例對照進行匯總分析，亦無證據表明CYP17 MspA1多態性與乳腺癌的發生相關。本研究中比較了CYP17基因多態性與維、漢兩民族乳腺癌的發病風險。其中，在維吾爾族組中，攜帶CYP17各基因型者均未顯示出增加患乳腺癌的風險，這與Surekha等[15]對印度高加索人群的研究結果一致。在漢族人群中，攜帶CYP17各基因型亦未顯示出增加漢族女性乳腺癌的發病風險，該結果與Yao等[16]對中國漢族人群該位點基因多態性與乳腺癌易感性的Meta分析中得出的結論一致。但本研究結果與大部分研究結果不一致，這可能是由于該基因的低外顯性及樣本量相對較小所導致的。

本研究僅對CYP17單個基因的單個位點的核苷酸多態性與乳腺癌易感性進行分析，尚不能確定是該位點本身或與其他位點多態性協同作用引起乳腺癌易感，因此，為了更加全面研究新疆維、漢女性乳腺癌的易感性，還需進一步研究新疆維、漢人群CYP17基因不同位點以及參與雌激素代謝的其它酶聯合突變與乳腺癌易感性的關聯的研究，同時還需再進行多中心、大樣本及更多已知的乳腺癌危險因子的綜合分析的研究，從而更好地服務于臨床，更好地指導新疆維吾爾族乳腺癌的個體化診斷及治療。

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(編輯：吳小紅)

Correlation between CYP17 Gene Polymorphism and Breast Cancer of Uygur and Han Women in Xinjiang

LIJing,GUOLi,LIYan,etal.

Objective To investigate the relationship between CYP17 rs743572 gene polymorphism and breast cancer susceptivity in Uygur and Han women.Methods Using the polymerasechain reaction-restrictive fragment length polymorphism(PCR-RFLP)method to examine the CYP17 rs743572 position spot polymorphism from 130 cases of Uygur patients with breast cancer,125 cases of Uygur normal women,120 cases of Han patients with breast cancer,and 118 cases of Han normal women,and to analyze the relationship between polymorphism at this spot and susceptivity with breast cancer.Results In the 2 groups of the Uygur and Han,the genotype distribution and allele frequency had significant difference (P<0.05).There was no significant difference between genotype distribution and allele frequencies in both groups of the Uygur and Han (P>0.05);Genotype and allele didn't increase the risk of breast cancer for both groups of the Uygur and Han.Conclusion In the 2 groups of the Uigur and Han,the genotype distribution and allele frequency have significant difference.CYP17 rs743572 polymorphism is not related to breast cancer in both Uygur and Han groups.

Breast cancer；CYP17 gene；Uygur；Han；Gene polymorphism

新疆維吾爾自治區科技廳自然科學基金(2013211A068)

830011 新疆醫科大學附屬腫瘤醫院

楊順娥

10.3969/j.issn.1001-5930.2015.11.003

R737.9

A

1001-5930(2015)11-1588-05

2015-04-20

2015-06-25)

TheAffiliatedTumorHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi,830011