2種檢測人腎綜合征出血熱IgG抗體ELISA試劑盒的比較

李卓，曾漢玉，馬櫻，劉媛，張戎，劉美寧，陳麗華

2種檢測人腎綜合征出血熱IgG抗體ELISA試劑盒的比較

李卓，曾漢玉，馬櫻，劉媛，張戎，劉美寧，陳麗華

目的探討國產與進口人腎綜合征出血熱（hemorrhagic feverwith renal syndrome,HFRS）IgG抗體ELISA檢測試劑盒的性能差異。方法采用國產和進口ELISA試劑盒分別檢測50例HFRS疫苗接種者血清樣本中抗人HFRS IgG抗體含量，分析比較2種ELISA試劑盒的一致性、靈敏性、精密度以及方法學等的差異。結果2種ELISA試劑盒的精密度良好，批內變異系數均＜5%；2種試劑陽性一致率為100%，陰性一致率為20%，相似率為60%；靈敏性檢測結果顯示，2種ELISA試劑盒的靈敏性差異較大（P＜0.05），國產ELISA試劑盒的靈敏度約是進口ELISA試劑盒的5倍。結論國產人HFRSIgG抗體ELISA檢測試劑盒靈敏性好，進口ELISA試劑盒特異性好，國產和進口ELISA試劑盒的精密度均良好，在實際應用中應根據具體情況合理選用。

漢坦病毒；腎綜合征出血熱；抗體；酶聯免疫吸附測定

腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS）是一種由漢坦病毒感染引起，以發熱、出血和急性腎損傷為特征的急性傳染病，90%以上病例發生在中國[1]，病死率為0.1%～10%[2]，是我國亟待控制的急性傳染病之一。該病毒在我國流行的血清型主要是Ⅰ型［漢灘病毒（Hantaan virus, HTNV）］和Ⅱ型［漢城病毒（Seoul virus,SEOV）］[3-4]，分別是我國姬鼠型和家鼠型疫區的主要流行毒株[5]。此病是一種自然疫源性傳染病，四季均可散發，每年11月至次年1月是其高發季節。我國對重點疫區的健康人群免費接種HFRS疫苗[6]，通常應用ELISA法檢測HFRS抗體的產生情況來評價疫苗的接種效果[7]。ELISA法以其靈敏、特異、簡便等特點已被廣泛應用于各個領域[8-9]，但不同試劑盒的檢測性能有所差異。本研究對國產和進口人HFRS抗體ELISA檢測試劑盒的性能進行了比較，旨在為臨床疾病的診斷和疫苗免疫效果的監測提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料50份血清樣本來自陜西省乾縣HFRS疫苗接種者。

1.2 主要試劑和儀器人HFRS抗體檢測試劑盒（ELISA法）（以下簡稱國產ELISA試劑盒）由上海市西唐生物科技有限公司生產；漢坦病毒IgG/IgM ELISA檢測試劑盒（以下簡稱進口ELISA試劑盒）由德國IBL公司原裝進口；HFRS抗體檢測試劑盒（膠體金法）（以下簡稱膠體金法試劑盒）由廈門市波生生物技術有限公司生產。檢測儀器為美國BIO-RADModel550型酶標儀。

1.3 檢測方法按照各種檢測試劑盒的使用說明書操作。國產和進口ELISA試劑盒的基本操作流程：稀釋血清、加樣、洗滌、加酶結合物、洗滌、顯色、終止后自動酶標儀讀值以及判定結果。膠體金法試劑盒基本操作流程：稀釋血清、加樣以及判定結果。

1.4 統計學處理應用SPSS 16.0軟件對實驗結果進行統計分析。列四格表，計算相應的指標。組間滴度差異性檢驗用Wilcoxon秩和檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 國產和進口ELISA試劑盒一致性按照國產和進口ELISA試劑盒對陰性和陽性結果的判定標準，在50份標本中，2種試劑盒檢測HFRS IgG抗體結果均為陽性的標本有25份，均為陰性的標本有5份。國產試劑盒相對于進口試劑盒陽性一致率為100%，陰性一致率為20%，相似率為60%（表1）。

表1 國產和進口ELISA試劑盒檢測HFRS IgG抗體的一致性(份)Table 1 Consistency between domestic and im ported ELISA kits for the detection of HFRS IgG antibody (sam ples)

2.2 國產和進口ELISA試劑盒靈敏性比較HFRS疫苗接種者HFRS IgG抗體陽性血清倍比稀釋后分別用國產和進口ELISA試劑盒進行檢測，按照2種試劑盒各自的判斷標準，選取最大稀釋比例的陽性孔作為其檢測靈敏性的數值（表2）。結果表明，國產ELISA試劑盒檢測10份HFRS IgG抗體陽性樣本的滴度大約高于進口ELISA試劑盒的5倍，說明國產ELISA試劑盒的靈敏性優于進口ELISA試劑盒。

2.3 國產和進口ELISA試劑盒精密度比較分別用國產和進口同一批次ELISA試劑盒檢測1份HFRS IgG抗體陽性血清，同時做20孔，計算檢測結果的批內變異系數。國產ELISA試劑盒的批內變異系數為3.3%，進口ELISA試劑盒的批內變異系數為2.4%，說明2種ELISA試劑盒精密度均較好。

2.4 國產和進口ELISA試劑盒與膠體金法試劑盒檢測結果的一致性

2.4.1 國產ELISA試劑盒與膠體金法試劑盒的一致性按照國產ELISA試劑盒與膠體金法試劑盒對陰性和陽性結果的判定標準，在50份標本中，2種方法檢測HFRS IgG抗體結果均為陽性的標本有33份，均為陰性的標本有5份。國產ELISA試劑盒相對于膠體金法試劑盒陽性一致率為100%，陰性一致率為29%，相似率為76%（表3）。

表2 國產和進口ELISA試劑盒檢測結果的靈敏性比較（滴度）Table 2 Com parison of the detection sensitivity obtained w ith the domestic and im ported ELISA kits(titer)

表3 國產ELISA試劑盒與膠體金法試劑盒檢測HFRS IgG抗體的一致性(份)Table 3 Consistency between the domestic ELISA kits and the colloidal gold method kits for the detection of HFRS IgG antibody(sam ples)

2.4.2 進口ELISA試劑盒與膠體金法試劑盒的一致性按照進口ELISA試劑盒與膠體金法試劑盒對陰性和陽性結果的判定標準，在50份標本中，2種方法檢測HFRS IgG抗體結果均為陽性的標本有25份，均為陰性的標本有17份。進口ELISA試劑盒相對于膠體金法試劑盒陽性一致率為76%，陰性一致率為100%，相似率為84%（表4）。

2.5 國產和進口ELISA試劑盒的方法學比較見表5。

3 討論

當人體感染漢坦病毒或接種HFRS疫苗后不久，在血清中就可檢測到HFRS抗體，最早產生的是HFRS IgM抗體，在7～10 d達到高峰，HFRS IgG抗體在發病大約2周時出現，可持續數年。檢測HFRS IgM抗體常用于疾病的早期診斷，檢測HFRS IgG抗體對于HFRS的診斷、流行病學調查和疫苗接種效果監測具有重要意義[10]。HFRS抗體檢測的方法有多種，如間接免疫熒光、ELISA、膠體金法和免疫組化法等。ELISA法因其靈敏、特異、簡單、穩定和易于自動化操作等特點，成為實驗室檢測病毒感染和血清抗體的主要方法之一，也是臨床檢驗科檢測HFRS的常用方法。市面銷售有多種國產和進口HFRS抗體ELISA檢測試劑盒，有必要對其檢測性能進行比較研究。本研究比較上海西唐生物科技有限公司和德國IBL公司原裝進口的HFRS抗體ELISA檢測試劑盒，分別用2種試劑盒檢測50份HFRS疫苗接種者血清標本的HFRSIgG抗體，一致性比較結果顯示二者的相似率為60%。2種試劑盒陽性檢出率有明顯差異，國產ELISA試劑盒陽性檢出率為90%，進口ELISA試劑盒陽性檢出率為50%。將HFRSIgG抗體陽性血清連續進行倍比稀釋后進行2種試劑盒的靈敏度檢測，結果表明國產HFRS試劑盒的靈敏度約是進口HFRS試劑盒的5倍。2種試劑盒結果判定標準不同，國產HFRS試劑盒以P/N（標本O.D值/陰性對照O.D值）≥2.1為陽性，進口試劑盒以Q（標本O.D值/參照質控O.D值）＞1.5為陽性。這些方法學的差異可能導致了國產ELISA試劑盒與進口ELISA試劑盒的檢出率和靈敏度差異較大。

表4 進口ELISA試劑盒和膠體金法試劑盒檢測HFRS IgG抗體的一致性(份)Table 4 Consistency between the im ported ELISA kits and the colloidal gold method kits for the detection of HFRS IgG antibody(samples)

表5 國產和進口ELISA試劑盒的方法學比較Table 5 Comparison of themethodology between the domestic and im ported ELISA kits for the detection of HFRS IgG antibody

本實驗結果表明國產ELISA試劑盒的陽性檢出率高于進口ELISA試劑盒，這可能與國產ELISA試劑盒采用SPA替代抗人IgG抗體有關。既往實驗表明，SPA替代抗人IgG抗體有如下特點：SPA制備容易，性質穩定，易于純化，能應用于人和多種哺乳動物的IgG，不受種屬限制，可制成通用試劑，價格較低廉，而抗人IgG抗體的制備須多次免疫動物，在應用上要受同種屬的限制[11]；SPA的結合力強，相當于游離抗體與抗原的結合力，結合后對IgG的活性無影響[12]；SPA無論在0、37、44、56℃均能立即與IgG結合而無需長時間孵育，因此可以縮短實驗時間[13]，且不易出現抗人IgG抗體長時間孵育過程中出現的抗原抗體解離的問題；但SPA除與IgG結合外，還能與血清中少量的IgM和IgA結合。鑒于此，SPA現已廣泛用于ELISA試劑盒的建立，如國內已建立檢測狂犬病病毒抗體的SPA ELISA試劑盒[14]、檢測冠狀病毒抗體的SPA ELISA試劑盒[15]以及用于檢測弓形蟲抗體的ELISA試劑盒[16]等。

分別用國產和進口同一批次ELISA試劑盒進行精密性實驗，計算檢測結果的批內變異系數。實驗結果表明國產和進口ELISA試劑盒的批內變異系數均小于5%，2種試劑盒的精密度均較好，意味著2種試劑盒檢測的重復性好。

膠體金層析技術作為一門成熟的實驗診斷技術，近年來已被廣泛應用于臨床診斷和免疫抗體的監測[17-18]，方法簡便、快速、不受條件限制，很適用于基層業務單位使用。據報道用于檢測EHF IgG抗體的膠體金法靈敏度和特異度分別為94.9%和100%[19]。國產和進口HFRS抗體ELISA檢測試劑盒與膠體金法試劑盒的一致性比較顯示：國產ELISA試劑盒與膠體金法試劑盒的相似率為76%；進口ELISA試劑盒與膠體金法試劑盒的相似率為84%。50份血清樣本中，膠體金法試劑盒的陽性檢出率為66%，介于國產與進口ELISA試劑盒之間。造成陽性檢出率差異顯著的主要因素是方法的靈敏性、試驗結果判定標準等。據檢測結果推測國產ELISA試劑盒靈敏度高，進口ELISA試劑盒特異性強。試劑盒的陽性率和一致性的差異提示要根據不同目的合理地選擇試劑盒。國產ELISA試劑盒靈敏，價格較便宜，適用于篩選實驗；進口ELISA試劑盒特異性強，可用于確證實驗；而膠體金法試劑盒操作簡單、檢測速度快，可用于臨床即時檢測。

綜上所述，國產和進口HFRS抗體ELISA檢測試劑盒均使用雙抗體夾心ELISA法，操作步驟基本一致，精密度良好，但二者在所用的酶結合物、結果判斷方法、靈敏性、特異性、一致性和價格等方面存在較大差異，在實際使用過程中應根據具體實驗目的合理地進行選用。

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Com parison of two ELISA kits for the detection of the IgG antibodies against hemorrhagic fever w ith renal syndrome

LIZhuo,ZENG Han-yu,MA Ying,LIU Yuan,ZHANG Rong,LIU Mei-ning,CHEN Li-hua*
Department of Immunology,the Fourth Military Medical University,Xi'an,Shaanxi710032,China
*Corresponding author,E-mail:chenlh@fmmu.edu.cn

Objective To investigate the performance differences in detecting hemorrhagic fever with renal syndrome(HFRS) IgG Antibodies between domestic and imported ELISA kits.M ethods Domestic and imported ELISA kitswere used to detect HFRS IgG antibodies of the serum samples from 50 HFRS vaccinators,and the consistency,sensitivity,precision and methodology of the two ELISA kitswere analyzed.Results Precision testshowed thatboth the domestic and the imported ELISA kitshad good precision,with the batch coefficientof variation of less than 5%.The positive consistency rate of the two ELISA kitswas 100%,the negative consistency rate was 20%,and the similarity rate was 60%.The sensitivity of the domestic ELISA kitswas 5 times higher than that of the imported ELISA kits,and the differencewas significantbetween the two ELISA kits(P＜0.05).Conclusions The sensitivity of the domestic ELISA kits is higher than that of the imported ELISA kits,the specificity of the imported ELISA kits is higher than that of the domestic ELISA kits,and both the domestic ELISA kits and the imported ELISA kits have good precision for the detection of HFRS IgG antibodies.The selection and application of the domestic or the imported ELISA kits depend on specific requirements.

Hantaan virus;hemorrhagic feverwith renalsyndrome;antibodies;enzyme-linked immunosorbentassay

R373.32；R512.8

A

1007-8134(2015)02-0092-04

國家科技重大專項（2013ZX1004609）；國家自然科學基金青年項目（81401297）

710032西安，第四軍醫大學免疫學教研室（李卓、曾漢玉、馬櫻、劉媛、張戎、陳麗華）；710054，西安市衛生學校醫學檢驗教研室（李卓）；712046，咸陽市疾病預防控制中心（劉美寧）

陳麗華，E-mail:chenlh@fmmu.edu.cn