成骨細胞中小凹和小凹蛋白在其增值分化等過程中的作用

郭俊峰綜述，譚穎徽審校

（第三軍醫大學附屬新橋醫院口腔科，重慶400037）

成骨細胞中小凹和小凹蛋白在其增值分化等過程中的作用

郭俊峰綜述，譚穎徽審校

（第三軍醫大學附屬新橋醫院口腔科，重慶400037）

近年來，小凹和小凹蛋白成為生物膜和細胞生物學領域的一個新熱點，越來越受到國內外學者的關注。尤其是當今社會，科學技術飛速發展，交通工具日新月異，交通傷害防不勝防，頜面部創傷的診治和修復顯得越來越重要，學者們對頜面部成骨修復研究也越來越多。成骨細胞中的小凹和小凹蛋白在成骨過程中的作用也越來越受到關注，本文簡要概括了成骨細胞中的小凹和小凹蛋白的相關作用。

1 小凹（Caveolae）及其蛋白質家族

1953年，Palade第一個用電子顯微鏡觀測到心臟連續內皮細胞上亞細胞結構Caveolae，并以“質膜囊泡”（plasmalemmal vesicles）命名。隨后，張勤勤等[1]在膽囊上皮細胞中也發現了類似的凹陷的“窩”狀結構。細胞質膜微囊即小凹（Caveolae）也稱作陷窩是一類50～100 nm大小的細胞膜上呈長頸瓶樣內陷入胞漿的細胞膜亞單位結構[2-3]，其含有小蛋白質（18～24 kDa），由小凹蛋白基因家族編碼，在哺乳動物中主要是Caveolin-1（Cav-1）、Caveolin-2（Cav-2）、Caveolin-3（Cav-3）[4-6]，Cav-1由在跨物種序列高度保守的三個外顯子組成，有兩個亞型：178個殘基的Cav-1a和147個殘基的Cav-1b，它們來自一個內部翻譯起始位點Met32[7]。Cav-2是由三個外顯子編碼的162個殘基的蛋白質組成，與Cav-1的基因序列高度相似。Cav-2α是完整的蛋白質，已確定有兩種其他亞型[8]，但是沒有特異性。Cav-3是由兩個外顯子編碼的151個殘基的蛋白質組成[9]。在小鼠中這3個基因定位于6號染色體上；在人類中，Cav-1和Cav-2基因定位到染色體位點7q31.1的D7S522的遺傳標記，其中包括已知的脆弱點附近（FRA7G），Cav-3定位到3p25。盡管假設Cav-1和Cav-2源自基因重復，但Cav-1和Cav-3卻具有高度一致的氨基酸序列[10]。Cav-1（也稱為Caveolin或VIP21）是小凹結構的基礎和標志蛋白，也是第一個被確定為小凹的結構部件和運輸高爾基體衍生的囊泡的家庭成員。根據細胞類型的不同，Cav-1可能有可溶性細胞質形式以及分泌形式[5,11]。Cav-1廣泛表達，在脂肪細胞、內皮細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞、成骨細胞及多種上皮細胞中高水平表達[10]。

Cav-2和Cav-3（也稱為M-caveolin）比Cav-1后發現。Cav-2與Cav-1常共表達，而Cav-3主要表達在橫紋肌細胞[5,11]。大多數的小凹在細胞和組織中的形成只需要Cav-1表達，而Cav-2的缺失并不影響小凹本身的形成，最近的研究表明Cav-2在Cav-1依賴的小凹動力學和專門的小凹蛋白功能中有一定的作用[12]。另一方面，在骨骼肌細胞和心肌細胞中的小凹主要由Cav-3形成[10]。

小凹和小凹蛋白參與囊泡運輸、細胞內外鈣穩態、膽固醇穩態和內吞作用[5,11]。此外，它們還在信號轉導、細胞增殖和腫瘤進展中發揮重要作用[12-13]。從功能上看，小凹和小凹蛋白對于區室化和各類信號分子（包括受體和非受體酪氨酸激酶，血管內皮型一氧化氮合酶，和小GTP酶等）的濃度以及干擾下游許多蛋白質和癌基因蛋白（如c-Src、H-Ras和增殖作用蛋白激酶等）的活性和信號轉導至關重要[5-6,11]。最近的研究也表明，小凹蛋白可以獨立發揮他們的作用，無論是在有小凹的細胞（如心肌細胞和成纖維細胞），還是那些缺乏小凹的細胞（如神經元和白細胞）中發揮作用[14]。因此，這些發現表明，小凹蛋白功能的實現不一定依賴于小凹的存在，這些蛋白質可能發揮與他們相關的小凹以外的和其他相關的生物學作用。同時，也可以根據需要重建小凹來恢復小凹依賴的相關功能，如用全長PTRF-CAVIN轉染重建小凹結構[15]。

由于小凹和小凹蛋白的普遍存在性和組織的差異表達，小凹蛋白對于正常細胞和組織的生理非常重要，并參與調控多種人類疾病。如小凹可以影響成骨細胞、破骨細胞等細胞的各種生理活動從而調控人體骨量穩態，小凹蛋白可以用于某些惡性腫瘤的輔助診斷等[16-17]。

2 小凹和小凹蛋白-1（Caveolin-1）與成骨細胞

成骨細胞中存在大量的小凹結構[18]，它主要表達Cav-1和Cav-2[19]，小凹結構是刺激感受裝置和信號集成平臺，它能濃縮并區室化信號分子，對信號傳播、放大甚至可以為各種信號因子之間的交換溝通創造局部環境[20]，其中，Cav-1的分布最為廣泛，是形成小凹結構的主要分子基礎和功能蛋白。在成骨細胞中，小凹及Cav-1在其成骨過程中起著重要作用。

正常小鼠和人的成骨細胞高水平的表達Cav-1和Cav-2，而檢測不到Cav-3的表達[21-23]，從功能上看，Cav-1對成骨細胞的生理學影響和功能似乎比Cav-2有更為密切的聯系，Cav-2不介導小凹的內陷，與Cav-1相比，Cav-2只能與很少的分子發生相互作用[24]。因此，在成骨細胞和骨組織中幾乎沒有Cav-2的相關研究，而到目前為止，大多數研究都聚焦在Cav-1及其如何影響成骨細胞分化、增殖、礦化等方面。

一些實驗研究表明，Cav-1可以通過調節內皮型一氧化氮合酶的酶活性作為成骨細胞的一個調節器。這種酶引起的一氧化氮的產生，是成骨細胞功能調節的重要介質，其定位于小凹結構中Cav-1腳手架域[23]。通過與內皮型一氧化氮合酶結合，Cav-1可以調節一氧化氮的產生，從而調節成骨細胞的活性。同時，在成骨細胞的小凹中發現一些Cav-1豐富的膜信號復合體，如生長因子受體、Src家族和絲裂原活化蛋白激酶信號通路酪氨酸激酶，可被Cav-1進行分選、加工、修飾進而在成骨細胞的生長和分化中發揮相應的作用[25]。其次，Cav-1可以通過多條胞內信號轉導通路（如MAPK/ERK、eNOS/NO、Wnt/β-catenin等）調節成骨細胞的分化成熟。

Rubin等[25]發現Cav-1有助于骨祖細胞保持低分化狀態，而它的缺失會導致骨成熟更迅速。換句話說，Cav-1可以調節細胞內信號向骨祖細胞傳遞，選擇性的阻止這些信號引起的成骨細胞分化。Boyan等[26]發現飼養8周的Cav-1沉默的小鼠生長板形態特征發生改變，包括骨小梁細胞過度增多且細胞肥大。提示Cav-1成骨細胞的增殖分化中有一定作用（圖1）。Janet等[27]通過Cav-1沉默的小鼠模型研究發現，其骨骼大小和勁度都有所增強，說明Cav-1在骨代謝中具有重要作用。此外，也有證據表明Cav-1基因參與調控成骨細胞介導的細胞外基質的鈣化。Rubin等[25]還發現Cav-1沉默的小鼠雖然具有正常的骨骼性狀，但在骨小梁內皮質骨的尺寸增大，堅硬的細胞外基質大量沉積。這些數據表明，Cav-1抑制骨基質礦化，與它抑制對成骨細胞分化的影響一致（圖1），但其具體作用機制依然不明。然而，Sawada等[24]研究強調Cav-1在骨礦化中發揮的作用是很復雜的。他們的研究表明，在小鼠成骨細胞MC3T3-E1中，當Cav-1過表達時，礦化增強，這個結論與上面的討論完全相反。Serra等[10]發現，在小鼠成骨細胞MC3T3-E1中，Cav-1以膜基質囊泡的形式分泌，釋放在細胞外基質，增加成骨細胞的分化。在小鼠成骨細胞MC3T3-E1中，沉默Cav-1會減少基質囊泡形成，表明分泌型Cav-1與增強骨細胞鈣化相關的膜基質囊泡的形成密切相關（圖1）。即Cav-1可以作為脂蛋白顆粒分泌到細胞外。我們推測，胞漿中分泌型Cav-1可以不通過小凹結構而作為膜基質囊泡直接參與和直接影響一些信號途徑，從而獨立的對成骨外基質的鈣化起著一定促進的作用。

圖1 [10]Cav-1參與成骨細胞分化和骨形成

2.1 雌激素/植物雌激素與Cav-1

成骨細胞分化為骨細胞經過了增殖、分化及礦化等三個不同時期，雌激素對這些階段均有不同程度的正性調節作用，多條信號轉導途徑介導了雌激素對成骨細胞分化相關基因表達的調控。近年研究表明，雌激素除通過經典的胞漿/核雌激素受體（ER）途徑之外，還可以通過胞膜ER信號途徑如內皮型一氧化氮合酶（eNOS/NO）等途徑調節成骨細胞的分化成熟，并在整體實驗中得到證實。

該研究發現胞膜ER、eNOS等信號分子和激酶均存在于的小凹結構中，雌激素對于增殖和礦化期小鼠成骨細胞MC3T3-E1中Cav-1蛋白表達無明顯影響，但可以劑量依賴性下調分化期細胞Cav-1表達，即Cav-1可以負性調控雌激素對分化期小鼠成骨細胞MC3T3-E1的促分化作用[28]。8-Prenylnaringenin（8-PN）是迄今發現活性最強的植物雌激素，其改善實驗性絕經后骨質疏松的作用已有報道。該研究發現，8-PN具有同雌激素類似的調節Cav-1對成骨細胞分化影響的作用，提示植物雌激素8-PN可促進小鼠成骨細胞MC3T3-E1的分化成熟，其促成骨細胞分化作用可能與Cav-1途徑有關[29]。

2.2 PTRF/cavin-1與Cav-1

PTRF/cavin-1在各種細胞中均高表達，包括脂肪細胞、成骨細胞和肌肉（心臟、骨骼、平滑肌）細胞。PTRF/cavin-1和磷脂酰絲氨酸具有高結合親，從而促進其摻入小凹結構；在小凹中，PTRF/cavin-1位于Ω形的細胞質膜微區，有研究證實，PTRF/cavin-1的丟失會導致小凹結構的減少，改變膜內組織信號通路，這可能會導致細胞行為改變[30]。同時，PTRF/ cavin-1與小凹的形成有關[30]，其在小凹中大量存在，并且與Cav-1共分布于小凹（位于小凹的胞漿側）中和細胞骨架蛋白有著密切的聯系[31-32]。新近研究表明，小凹蛋白與PTRF/ cavin-1在細胞的遷移中起重要的作用，提示PTRF/cavin-1可能在Cav-1和小凹的上游介導細胞的遷移。而過度表達PTRF/cavin-1或者下調PTRF/cavin-1的表達能引起Cav-1表達量相應的改變[33]。

有研究表明PTRF/cavin-1可以改變前列腺癌細胞來源的細胞外小泡和內化衰減外囊泡介導的成骨細胞和破骨細胞增殖[15]。但其具體作用途徑、作用效應與機制還不明確，尤其是在前列腺癌的研究中，成骨細胞和破骨細胞在前列腺癌發生發展中的作用等相關問題還有待進一步探討。同時，相關研究還指出PTRF/cavin-1和Cav-1共定位與小凹結構，直接與細胞骨架網絡相互作用，形成Caveolae-caveolin-1-PTRF/cavin-1這樣一個相互溝連的極為復雜的調控系統，為細胞內外各種信號分子、信號通路等提供了一個交換溝通的大型分子平臺。目前，這方面的研究主要在心血管系統中的血管平滑肌方面[33]，而在成骨細胞中還未見相關報道，因此我們可以對其進行進一步的深入研究。

2.3 Wnt/β-catenin信號通路與Cav-1

近年來的研究表明，Wnt/β-catenin途徑在促進成骨細胞分化方面具有十分重要的作用。通過Wnt信號途徑可以增加骨量，包括更新干細胞，誘導成骨細胞形成及抑制成骨細胞和骨細胞凋亡等[34-35]。Galbiati等[36]在MDCK細胞中使用共聚焦顯微鏡觀察到Wnt通路的核心分子β-catenin濃縮于小凹中，與小凹形成穩定的復合物。Cav-1可以調整βcatenin的核定位[37]，研究結果提示β-catenin在小凹結構中的定位與解離平衡對于Wnt/β-catenin信號的轉導有重要作用。Cav-1可以通過Wnt/β-catenin通路調節成骨細胞成熟分化過程，小鼠成骨細MC3T3-E1分化成熟過程中下調Cav-1表達后，使β-catenin游離從而被降解，儲備β-catenin數量下降，導致礦化期Wnt/β-catenin信號消減，有利于鈣化結節的形成，但不影響基質形成期[38]。

3 鈣敏感受體（CaSR）、Cav-1與成骨細胞

在骨骼中，細胞外鈣離子招募刺激骨祖細胞增殖、分化為成熟的成骨細胞，并形成骨及使之礦化。細胞外鈣離子可能通過CaSR抑制破骨細胞的形成和活性，CaSR動員細胞外鈣離子往往是在鈣離子缺乏和當鈣離子豐富而又需要保留在骨骼中時發生[39]。Chang等[40]用小鼠模型證明了在成骨細胞和軟骨細胞中的CaSR是調節骨骼發育的關鍵調節器。CaSR在通過感知血液中鈣離子濃度的細微變化和產生/分泌鈣離子調節激素，甲狀旁腺激素、降鈣素、FGF23和1,25（OH）2D3維持鈣離子穩態，以便適當的調節鈣離子通過腎臟、腸、骨進入或者排出血液。此外，Cav-1除了參與骨的形成，它似乎也參與細胞內外鈣離子穩態的調節和影響骨吸收，如圖2所示，體內鈣穩離子態由成骨細胞和破骨細胞的活性來調控。Jung等[41]獲得的證據表明，Cav-1可能通過結合CaSR和調節其活性來調控生理性鈣離子穩態。在骨細胞中，CaSR和Cav-1共定位于小凹，并形成蛋白質-蛋白質復合體。在正常生理條件下，Cav-1參與調節細胞外鈣離子濃度增加。

眾所周知，改變細胞外鈣濃度會改變破骨細胞的形態和抑制骨吸收[42]，在成骨細胞中細胞外鈣濃度的增加誘導增殖反應從而使骨形成增強，與此一致，更多的證據表明，增加吸收陷窩局部鈣離子濃度，通過CaSR介導的細胞外鈣濃度升高來抑制破骨細胞的骨吸收活性，這對骨量的調節非常重要[10]。因此，這些研究結果的基礎上，可以得出的結論，Cav-1在體內骨重建和/或CaSR相關的疾病的病理生理過程中起重要作用。同時，Hu等[43]研究發現，升高細胞外鈣離子濃度可以刺激CaSR，激活磷脂酶C（PLC），然后開放鈣庫操作性鈣離子通道（SOCE），最終引起細胞內鈣離子濃度升高。這個過程在成骨細胞增殖中被細胞外高濃度鈣離子所誘發。這個發現可促進對成骨細胞增殖機制形成新的認識，也可以提供一些骨重建的生理調節提供細胞學基礎。

圖2 [10]：Cav-1在鈣和骨穩態中的作用

4 結論

綜合目前已發表的文獻可知，Cav-1參與成骨細胞分化和骨形成，在鈣離子和骨的穩態調節中起著至關重要的作用；同時CaSR也定位在小凹結構上，影響成骨細胞的增值和分化，也協同參與調節細胞內外鈣離子濃度，從而維持細胞內外鈣離子濃度；Cav-1還可以與其他相關分子（如雌激素、8-PN、PTRF/cavin-1、Wnt/β-catenin、MAPK/ERK、eNOS/ NO等）共同調節細胞內的各種生命活動等，但它在這些過程中的具體作用仍然有待進一步研究。

小凹結構是一個信號平臺（即小凹結構中有大量的信號分子和信號通路），其中的小凹蛋白參與細胞內外信號轉導網絡的構成，其作用機制并不是十分清楚，還需要更深入的研究來證實小凹、Cav-1以及其他小凹蛋白在骨組織生物學和生理學中的作用。相信隨著研究的深入，成骨細胞中的小凹和小凹蛋白及小凹平臺上的各種信號分子以及信號分子通路，都將會被人們闡述清楚，進而為治療骨骼相關疾病提供新的思路。

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（2015-06-20收稿）

R782.2，R782.4

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2015.06.020

郭俊峰（1990-），男，碩士生。E-mail：229713862@qq.com