白芍多糖顆粒活性炭脫色試驗研究*

秦亞東，周娟娟，汪榮斌,3

（1安徽中醫藥高等專科學校藥學系，2蕪湖市中醫醫院制劑中心，3安徽中藥資源研究所，安徽蕪湖241317）

白芍多糖顆粒活性炭脫色試驗研究*

秦亞東1，周娟娟2，汪榮斌1,3

（1安徽中醫藥高等專科學校藥學系，2蕪湖市中醫醫院制劑中心，3安徽中藥資源研究所，安徽蕪湖241317）

目的：優化白芍多糖顆粒活性炭脫色工藝。方法：以多糖脫色率和多糖保留率為指標，探索顆粒活性炭用量、pH值、吸附時間、脫色溫度對白芍多糖脫色效果的影響。結果：顆粒活性炭對白芍多糖最優脫色工藝為：顆粒活性炭用量濃度1.5%，溫度為25℃，調節pH=7.5，脫色2 h。白芍多糖脫色率為64.25%，保留率為71.33%。結論：顆粒活性炭可用于白芍多糖的脫色。

白芍；多糖；顆粒活性炭；脫色試驗

糖是自然界中含量最豐富的生物聚合物，絕大部分生物都含有多糖。近些年來從中藥提取出來的多糖已被證實具有多種生物活性并已經在臨床上正式應用的藥物，如靈芝多糖[1]、香菇多糖等[2]。隨著對中藥多糖研究的不斷深入，從中藥材中提取出來的多糖一般多為總多糖，由于多糖中存在著一些核酸、蛋白質、色素等雜質，這些雜質的存在嚴重干擾和阻礙了多糖的進一步研究。故而多糖除雜，提高其純度，更利于多糖的理化性質、生物活性等方面的深入研究。大部分中藥多糖溶液具有顏色，不僅影響了多糖的純度，更給多糖的深入研究帶來了一定的困難。因此中藥多糖脫色工藝就成了精制多糖的重要環節。

多糖溶液脫色方法[3-4]主要有有氧化法（過氧化氫、次氯酸鈉等）、離子交換法（各種不同型號的樹脂）、金屬絡合法、吸附法（活性炭、硅藻土等）。氧化法有可能對多糖的三維空間結構產生影響，離子交換樹脂法可能對不同類型的多糖產生的作用不同。顆粒活性炭較易于從多糖溶液中濾除，活性炭比表面積較大，物理吸附，一般不會對多糖的空間結構產生影響。基于以上原因，本文選擇活性炭作為脫色劑研究其對白芍多糖脫色效果的影響。為白芍多糖的脫色工藝提供一些參考。

1 材料與儀器

美國Agilent紫外分光光度計Cary60、德國SIGMA離心機3-18K、瑞士梅特勒電子天平MS104S、河北武強縣億達儀表廠華強酒精計；試驗所用白芍采集于安徽亳州地區白芍種植基地，由安徽中藥資源研究所劉曉龍研究員鑒定為Paeonia lactiflora Pall；葡萄糖(中國食品藥品檢定研究院，批號：110833-201205)、苯酚等試驗用試劑均為分析純。

2 方法和結果

2.1 白芍多糖的制備

取白芍干燥根莖約100 g，粉碎，過60目篩，加10倍量無水乙醇浸泡過夜，濾過，濾渣再加8倍量無水乙醇浸泡過夜，濾過，除去可以溶于醇部分的小分子雜質、部分色素等雜質。

保留藥渣、置于通風處，自然干燥，分別使用8倍量、6倍量蒸餾水回流提取2次，每次2 h，合并濾液，水浴濃縮至適量。放至室溫，慢慢加入無水乙醇同時振搖，調節乙醇濃度為90%，置于冰水浴中，靜置過夜，離心得到多糖沉淀，使用無水乙醇反復沖洗數次，真空減壓干燥即得白芍多糖粉末。

2.2 白芍多糖溶液的配制

取“2.1”項下制備的白芍多糖干燥粉末約100 mg，用蒸餾水定容于50 mL量瓶中，60℃加熱以促進溶解，然后5 000 r/min離心，去除不溶部分。即得橙黃色白芍多糖溶液，濃度為2 mg/mL。

2.3 色素最大吸收波長的選擇

取“2.2”項下制備的溶液在可見光區（400 nm-700 nm）進行掃描，結果發現沒有最大吸收，色素吸收呈現普遍吸收的特點。從溶液互補色角度考慮，選擇450 nm為色素吸收檢測波長。

2.4 標準工作曲線制備

精密吸取葡萄糖標準溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL分別置于具塞棕色試管中，于上述5只試管中按順序分別加入0.9、0.8、0.6、0.2、0.0 mL蒸餾水，再加6.0%的苯酚溶液1.0 mL，振搖均勻，最后加濃硫酸5.0 mL，立即振搖均勻后，100℃水浴中加熱20 min，取出放至室溫，490 nm波長下測定吸光度（A）值。以蒸餾水同法操作，作為空白對照。以葡萄糖濃度(C, μg/mL)為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，得到回歸方程：A=8.3643C+0.0285（r=0.9995）。試驗結果表明，葡萄糖標準溶液濃度在2.4～14.4 μg/mL之間，其濃度與吸光度呈良好的線性關系。

2.5 多糖脫色率、保留率的測定

多糖含量采用經典的硫酸-苯酚顯色法進行測定，顯色后在490 nm下測定A值，并按多糖保留率（%）=脫色后多糖含量/脫色前多糖含量×100%來計算，多糖含量依據葡萄糖標準工作曲線進行計算，顯色操作方法見“2.4”；在450 nm下測定脫色前后多糖溶液吸光度A值，脫色率按脫色率（%）=（溶液脫色前吸光度值-溶液脫色后吸光度值）/溶液脫色前吸光度值×100%來進行計算。

2.6 顆粒活性炭脫色單因素試驗

取“2.2”項下制備的白芍多糖溶液（2 mg/mL），每組取20 mL進行顆粒活性炭脫色單因素試驗，分別考察加入量、pH、溫度、時間對脫色率、多糖保留率的影響。

2.6.1 顆粒活性炭加入量對多糖脫色效果的影響

取“2.2”項下制備的白芍多糖溶液（2 mg/mL）6份，每份20 mL，用0.1%NaOH調節pH=8，分別加入不同百分含量（顆粒活性炭質量/多糖質量百分比）的顆粒活性炭，25℃下脫色處理3 h。按“2.5”項下方法測定并計算脫色率及保留率。

圖1 活性炭濃度對脫色效果的影響

由圖1可見，當顆粒活性炭濃度從0.5%增大到1.5%的過程，多糖的脫色率增加幅度較大，多糖的保留率緩慢降低；當顆粒活性炭濃度超過1.5%后，多糖脫色率增加幅度大大降低，同時多糖保留率下降較為劇烈。因此，顆粒活性炭用量不宜超過1.5%。2.6.2脫色時間對多糖脫色效果的影響

取“2.2”項下制備的白芍多糖溶液（2 mg/mL）6份，每份20 mL，用0.1%NaOH條件pH=8，加入1.5%的顆粒活性炭，在25℃下考察不同脫色時間對脫色效果的影響。按“2.5”項下方法測定并計算脫色率及保留率。效果的影響。按“2.5”項下方法測定并計算脫色率及保留率。

由圖2可見，脫色時間在1～2 h內隨著時間的增加，脫色率增加幅度較大，多糖保留率迅速降低；當脫色時間超過2 h以后脫色率及多糖保留率均變化緩慢。因此脫色時間為2 h，效果較理想。

2.6.3 pH對多糖脫色率及保留率的影響

取“2.2”項下制備的白芍多糖溶液（2 mg/mL）6份，每份20 mL，用0.1%NaOH條件pH=8，加入1.5%的顆粒活性炭，在25℃下考察不同脫色時間對脫色效果的影響。按“2.5”項下方法測定并計算脫色率及保留率。

由圖3可見，多糖溶液pH值從酸性6.5增加到堿性9.0的過程中多糖保留率在逐漸下降，而多糖脫色率在pH=7.5時有一峰值，再繼續增加pH，脫色率緩慢降低而后趨于穩定。綜上考慮pH=7.5較為合適。

2.6.4 溫度對多糖脫色率及保留率的影響

取“2.2”項下制備的白芍多糖溶液（2 mg/mL）6份，每份20 mL，用0.1%NaOH條件pH=8，加入1.5%的顆粒活性炭，分別在不同的溫度下考察脫色時間對脫色效果的影響，脫色時間為3 h。按“2.5”項下方法測定并計算脫色率及保留率。

由圖4可見，在25～45℃范圍內，脫色率及保留率變化均不明顯，且溫度逐漸增高后多糖保留率呈下降趨勢。另外從節能角度綜合考慮，確定25℃為脫色溫度。

2.7 正交試驗

由單因素試驗結果，選取顆粒活性炭濃度、脫色時間、pH為因素，設計3因素3水平進行正交試驗，正交設計表L9（33）表1、3，考慮到脫色作用體現在脫色率及多糖保留率兩個方面，故各賦予50%加權，求得加權后的綜合得分=脫色率/2+多糖保留率/2。

圖2 脫色時間對對脫色效果的影響

圖3 pH對對脫色效果的影響

圖4 溫度對對脫色效果的影響

表1 因素水平表

表2 正交試驗設計表及結果

表3 方差分析表

由表2、3可以看出，各因素對脫色率的影響主次為A＞C＞B、對多糖保留率影響主次為B＞C＞A；其中A因素為主要因素，且具有呈顯著性差異，故應選A3、B因素從脫色率角度看應選B2，且在保留率方面無顯著性差異，故選B2；C因素分析同B因素，故選C2。故最佳脫色條件為A3B2C2,即：加入多糖的1.5%顆粒活性炭，脫色溫度為25℃，調節pH= 7.5,吸附2 h。

2.8 驗證試驗

取“2.2”項下制備的多糖溶液，按照最優脫色方案A3B2C2進行脫色試驗，測得脫色率及多糖保留率平均值分別為65.16%、71.53%,RSD分別為1.36%（n =5）、2.07%（n=5）。試驗結果證實上述方案為最優方案，結果重復性符合要求。

3 討論

本文使用水提醇沉技術得到白芍多糖，呈黃色粉末狀。制備成2 mg/mL溶液使用紫外可見分光光度法在可見光區掃描未發現色素存在最大吸收波長，根據溶液的顏色及互補色，選擇450 nm作為色素吸收波長。

中藥多糖一般多具顏色，這些顏色為不同色素所形成，由于色素的存在，嚴重影響了中藥多糖的進一步研究和利用。目前中藥多糖提取液脫色的方法主要包括化學法、物理吸附法等，化學法一般采用雙氧水、次氯酸鈉等試劑對多糖溶液進行脫色，由于在脫色過程中可能對多糖產生氧化作用，為了較好的保留多糖活性，故應慎用；樹脂脫色成本高、操作復雜，難于工業化使用，因此工業化使用較少；而活性炭具有無毒、無味、可反復使用、效率高、速度快、成本較低等特點[5]，對多糖空間結構較少產生影響，因此為進一步研究多糖結構提供了可靠的脫色方法。一般脫色機理認為是物理吸附，當有色成分直徑小于活性炭孔入口直徑，即可被吸附。當然也存在一些缺點，例如對分子直徑較小的多糖也產生一點的吸附作用，這樣是否會改變多糖組成成分還有待于進一步研究證實，另外活性炭再生較為困難等。為了盡量保持脫色后多糖的生物活性，另外考慮脫色后活性炭的濾除難度，故沒有研究粉末活性炭的脫色部分，課題組在前期研究的基礎上[6-7]，繼續研究了顆粒活性炭的脫色工藝，經試驗研究，本工藝具有較好的操作性，工業化可實施性。

1.Lin ZB,Zhang HN.Anti-tumor and immunoregulatory activities of Ganoderma lucidum and its possible mechanisms [J].Acta Pharmacol Sin,2004,25(11):1387-1395.

2.方積年，王順春.香菇多糖的研究進展[J]，中國藥學雜志，1997,32（6）:332-337.

3.付學鵬,楊曉杰.植物多糖脫色技術的研究.食品研究與開發[J],2007,28(11):166-169.

4.方積年,丁侃.天然藥物-多糖的主要生物活性及分離純化方法.中國天然藥物[J],2007,5(5):338-347.

5.沈鐵煥,魏青,時運銘,等.不同行業如何使用活性炭.石家莊師范專科學校學報[J],2000,4(2):35.

6.秦亞東,李飛,周宙.不同提取方式對白芍化學成分含量的影響.現代中藥研究與實踐[J],2014,28(4):50-53.

7.秦亞東,周娟娟,李飛,等.白芍生品及其炮制品中多糖及總糖的含量測定[J]，長春中醫藥大學學報,2014,30(5):804-807.

（2015-02-05收稿）

Experimental studies on the decoloration of Paeoniae Radix Alba Polysaccharide using granular activated carbon

Qin Yadong1,Zhou Juanjuan2,Wang Rongbin1，31Department of Pharmacy,Anhui Higher Institute of Traditional Chinese Medicine,2Preparation Center，Wuhu Hospital of Traditional Chinese Medicine,3Anhui Institute of Chinese Medicine Resources,Wuhu 241317,Anhui Province,China

Objective：To optimize the decoloring conditions for Paeoniae Radix Alba Polysaccharide using Granular activated carbon.Methods：The decoloring effect of granular activated carbon was studied and the conditions for decoloring were optimized through single factor test.Results:The optimal conditions are∶temperature 25℃,1.5%granular activated carbon adjusted to pH=7.5,and maintained for 2 hours.The decolorization rate and polysaccharide retention rate of Paeoniae Radix Alba polysaccharide are 64.25%and 71.33% respectively.Conclusion：Granular activated carbon can be used for decolorization of polysaccharides of Radix Paeoniae Alba.

Paeoniae Radix Alba;Polysaccharide;Granular activated carbon;Decoloring experiment

R284

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2015.06.004

安徽省高校省級科研項目(KJ2013B114)；安徽省高職高專院校專業帶頭人（皖教秘人〔2011〕2號）

秦亞東(1979-)，男，講師，碩士。E-mail:qydgy2007@163.com