DS1226對人乳腺癌細胞ZR-75-30細胞增殖、凋亡和運動的影響*

李娟，王瓊，郭侃，甘淋

（四川醫科大學醫學基礎研究中心，四川瀘州646000）

DS1226對人乳腺癌細胞ZR-75-30細胞增殖、凋亡和運動的影響*

李娟，王瓊，郭侃，甘淋

（四川醫科大學醫學基礎研究中心，四川瀘州646000）

目的：檢測人參復合物制劑DS1226對人乳腺癌細胞細胞ZR-75-30細胞增殖、凋亡和運動的影響。方法：體外培養人乳腺癌細胞ZR-75-30，予DS1226干預組為DS1226組（實驗組），無藥物組為對照組。CCK8檢測DS1226對ZR-75-30細胞增殖的影響，流式細胞術檢測細胞凋亡和細胞周期的改變，進一步用細胞劃痕實驗檢測劃痕愈合率。結果：與對照組相比較，CCK8結果顯示DS1226時間依賴性抑制人乳腺癌細胞ZR-75-30的細胞增殖，24 h、48 h和72 h的細胞增殖抑制率分別是3.01±0.12%，13.10±0.51%和23.66±4.85%（P＜0.01）；FACS結果顯示DS1226干預組的凋亡率從干擾前3.20±0.14%增強至藥物刺激后的7.17±0.32%（P＜0.05）；劃痕實驗顯示DS1226干預組24 h與對照組相比劃痕愈合明顯下降（P＜0.01）。結論：人參復合物制劑DS1226能顯著抑制人乳腺癌細胞ZR-75-30的細胞增殖、增強細胞凋亡和降低細胞運動能力。

DS1226;乳腺癌；增殖；凋亡；運動

乳腺癌（Breast Cancer）是女性最常見的惡性腫瘤，其致死率居女性腫瘤死亡率第二位。近年來其發病率與死亡率不斷升高，2008年全球確診腫瘤中23%為乳腺癌，腫瘤死亡病例中約14%為乳腺癌[1]。但是乳腺癌的發病機制不明，目前仍缺乏高效敏感的早期診斷分子標志物和治療方法，且特效的乳腺癌治療藥品也有待進一步的研究。

人參是一種得到臨床認可的，在國內外都得到廣泛應用的一種中藥，目前越來越多的應用于造血系統、心血管系統、神經系統疾病和化療輔助治療等方面，但是在腫瘤治療方面的研究尚有待進一步深入[2-3]。本研究所采用的藥物DS-1226是由人參干燥莖葉抽提的總皂苷水解而成，包括原人參二醇（aPPD）、原人參三醇（aPPT）、人參皂苷Rh2和PAM120等多種成分[4]。

本實驗從細胞水平出發，采用CCK-8、流式細胞術、劃痕實驗等常用分子生物學方法研究人參制劑DS-1226對人乳腺癌細胞增殖、凋亡、運動能力的影響，進而解析人參皂甙DS-1226成為乳腺癌治療藥物的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細胞系ZR-75-30由四川醫科大學醫學基礎研究中心保存；DMEM培養基和胎牛血清均購自美國Gibco BRL公司；Cell Counting Kit-8試劑盒購自日本同仁化學研究所；膜連蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素凋亡試劑盒購自美國BD公司。其余試劑均為化學分析純。酶標儀為美國Thermo公司產品；流式細胞檢測儀為美國的BD公司；細胞劃痕實驗結果用Image Pro軟件分析。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及藥物干預：

人乳腺癌細胞ZR-75-30貼壁生長于含10%胎牛血清的DMEM培養液中，置37℃、5%CO2的細胞培養箱內傳代培養；以加入終濃度為5 μg/mL DS1226的細胞為DS1226組，以不加入DS1226的細胞為對照組。DS1226均是實驗前即時配制。

1.2.2 細胞增殖實驗

將3.0×103個ZR-75-30細胞/孔傳代于無菌96孔培養板中。須單獨設置空白孔（僅有培養基）、對照孔和實驗孔（皆鋪有細胞的培養基）。每組設四個平行孔。次日用DS1226作用實驗組細胞，同等體積PBS作用細胞組為對照組，置37℃、5%CO2培養箱培養。培養24 h、48 h和72 h后，每孔加入Cell Counting Kit-8溶液10 μL；37℃培養箱中繼續溫育1 h。用酶標儀讀取各孔在450 nm的吸光度，以各時間點的吸光度繪制生長曲線。

1.2.3 細胞凋亡（AnnexinV+PI）的流式細胞儀檢測

ZR-75-30細胞按每孔4.5×105個細胞數接種于6孔培養板中，設對照組和DS1226實驗組（DS1226作用24 h），次日收集每孔中的細胞和培養液后PBS漂洗2次。依次加入AnnexinV凋亡染色試劑盒中的結合緩沖液20 μL、AnnexinV和PI工作液各5 μL，室溫避光染色15 min后上機檢測。

1.2.4 細胞周期的檢測

ZR-75-30細胞按每孔4.5×105個細胞數接種于6孔培養板中，設對照組和DS1226實驗組（DS1226作用24 h）。收集細胞用預冷的70%酒精固定30 min。用PBS洗滌1次后加入RNase A(工作濃度20 μg/ mL，37℃孵育30 min。PBS洗滌后加入PI(工作濃度50 μg/mL)，避光孵育30 min。流式細胞儀上機檢測。

1.2.5 劃痕實驗

ZR-75-30細胞按每孔4.5×105個細胞數接種于6孔培養板中，形成單層貼壁細胞，設對照組和DS1226實驗組（DS1226作用24 h）。當細胞鋪滿孔板，用10 μL移液器槍頭在單層細胞上劃痕，孵育24 h后去除培養基，PBS洗滌2次后光學顯微鏡下拍照觀察。每組實驗重復3次。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 DS1226對ZR-75-30細胞增殖的影響

Cell Counting Kit-8細胞增殖實驗結果顯示，5.0 μg/mL DS-1226作用ZR-75-30人乳腺癌細胞24 h、48 h和72 h后，DS1226組的細胞增值較對照組均明顯下降，差異均有統計學意義（P＜0.01），（圖1）。DS1226組的細胞生長抑制率在作用24 h、48 h和72 h分別為3.01%±0.12%，13.10%±0.51%和23.66%±4.85%，DS1226組的細胞生長抑制率隨著時間推移逐漸增加（P＜0.01，圖1）。

圖1 DS1226對人乳腺癌細胞ZR-75-30細胞增殖的作用

2.2 DS1226誘導ZR-75-30細胞凋亡

聯合Annexin V和PI的方法檢測DS1226對乳腺癌細胞ZR-75-30的細胞凋亡變化。流式細胞儀分析結果如圖2所示，與對照組比較，DS1226實驗組的凋亡明顯增加，細胞凋亡從藥物干擾前的3.20%±0.14%上調至干擾后的7.17%±0.32%（P＜0.05）。

圖2 流式細胞儀檢測細胞凋亡

2.3 DS1226不影響ZR-75-30細胞的細胞周期

流式細胞術檢測DS1226作用ZR-75-30后細胞周期的變化。實驗發現經DS1226處理之后，人乳腺癌細胞ZR-75-30細胞周期（G1期47.71%± 1.65%，S期32.81%±1.02%）與對照組（G1期45.71%±2.17%，S期34.65%±1.49%）沒有明顯改變（P=0.078）。

2.4DS1226抑制ZR-75-30細胞運動

劃痕實驗結果顯示，5.0 μg/mL DS1226作用人乳腺癌細胞ZR-75-30 24 h后，DS1226組的細胞運動能力較對照組下降，細胞劃痕愈合能力下降（圖3）。

圖3 對照組與DS1226組劃痕實驗結果（x 200）

3 討論

流行病學調查發現乳腺癌高發于經濟發達國家，比如美國、歐洲、日本等，如2011年美國乳腺癌新增病例為230,480例，死亡人數則高達39,520人[1]。近年來的研究提示：乳腺癌在發展中國家的發病率、死亡率正在逐漸增高，在中國的一些大城市乳腺癌已經逐漸成為威脅婦女生命的重要殺手[5]。故而能早期診斷、治療乳腺癌非常重要。中藥抗腫瘤可以通過多種機制參與腫瘤生長、增殖、凋亡、代謝等過程,減少患者的腫瘤復發轉移，延長患者生存期。目前在傳統中藥材中尋找高效、低毒的抗癌藥物已成為國內外研究焦點。

人參作為一味傳統的中藥材，廣泛應用于心血管、造血系統、神經系統疾病和放化療輔助治療。至今從人參中已分離鑒定40多種人參皂甙化合物，如Rb1、Rg1、Rg3、Rd等，發揮抗炎癥、抗氧化、血管舒張、抗老化、抗腫瘤等多種作用[6-8]。最近五年已有超過1100篇的論文，但是關于人參制劑對腫瘤的預防治療作用的研究甚少。然而單方的人參皂苷晶體提純過程復雜，作用單一，價格昂貴，不適合大規模臨床使用。故而本實驗選擇了人參復合物制劑DS1226膠囊進行試驗。

我們以高侵襲的的ZR-75-30人乳腺癌細胞為研究對象，檢測DS1226對乳腺癌細胞細胞增殖、凋亡、遷徙運動的影響，探討DS1226作為乳腺癌治療藥物的可能性。我們的研究發現5 μg/mL人參復合物制劑DS1226作用ZR-75-30細胞24 h后，能抑制ZR-75-30細胞增殖，促進細胞凋亡，提示DS1226可能發揮抗乳腺癌發生的作用。這和其他一些研究小組的結果是相似的。Sharma等[9]發現人參根莖提取物治療皮膚癌時，可以通過降低谷胱甘肽、維生素C、超氧化歧化酶等明顯降低腫瘤的發生率，腫瘤的數目和大小。He研究小組在人肺癌、鼻咽癌及結腸癌等多個細胞株中發現，人參提取物能劑量依賴性的抑制腫瘤細胞的增殖，發揮抗腫瘤的作用[10]。Kim也發現在人乳腺癌細胞系MCF-7和MDAMB-435細胞中，人參單方制劑Rg3、Rg5都能通過多種信號通路調控細胞凋亡，其中Rg5促進凋亡的能力更強[11]。這些結果證實人參制劑確實能發揮抗腫瘤生成的作用，為人參制劑的臨床應用提供了研究基礎。

在此基礎上，我們進一步研究發現DS1226抑制ZR-75-30乳腺癌細胞細胞運動，提示DS1226對乳腺癌的進展有一定的抑制作用。Wang等[12]從人參里面提取的多糖，并進一步在大鼠Lewis肺癌的動物模型上檢測其抗腫瘤的作用。發現這種多糖物質能顯著抑制肺癌的生長，并能抑制肺轉移瘤的產生；同時還能增加脾臟和胸腺的重量，促進LPS誘導的脾淋巴細胞增殖，提高脾臟NK細胞的活性，增加白介素2和干擾素的表達，提示抽提的人參多糖物質能激活免疫功能有效抑制肺癌的轉移。另有研究發現一種脂溶性的人參抽提物（LSGE）能通過抑制MMP2的表達有效抑制小鼠黑色素瘤細胞B16F10的運動和侵襲，甚至能抑制體內的黑色素瘤細胞的肺轉移[13]。這些結果提示人參可能在腫瘤的侵襲轉移中發揮治療效果。

總之，我們的研究發現人參復合物制劑DS1226能顯著抑制人乳腺癌細胞ZR-75-30的細胞增殖、增強細胞凋亡和降低細胞運動能力。這為進一步探討人參的臨床推廣應用奠定了實驗基礎和提供了臨床指導。

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（2015-08-31收稿）

作者投稿系統http∶//xb.lzmc.edu.cn/

Effects of DS1226 on proliferation,Apoptosis and migration of human breast cancer cell line ZR-75-30

Objective：To study the effect of Ginseng compound DS1226 on proliferation,apoptosis,and migration of human breast cancer cell line ZR-75-30.Methods：Cultured ZR-75-30 cells were treated with DS1226 as trial group and without DS1226 as control group.Cell proliferation was determined by CCK8 assay, cell apoptosis and cell cycle were analyzed by FACS,and cell migration was evaluated by scratch assay.Results: Compared to control group,DS1226 significantly decreased the proliferation of ZR-75-30 cells in a timedependent manner(P＜0.01),induced cell apoptosis(P＜0.05),and reduced the rate of wound closure(P＜0.01). Conclusion:DS1226 inhibits cell proliferation and migration,and enhances cell apoptosis in human breast cancer cell line,ZR-75-30.

DS1226;Breast cancer;Proliferation;Apoptosis;Migration

R737.9

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2015.06.002

*國家自然基金項目（No:81341121）；四川省科技廳—瀘州市—瀘州醫學院聯合課題（14JC155）；瀘州市科技局課題（2012-S-36（3/14）

李娟(1978-)，女，副教授，碩士。

甘淋(1978-)，女，副教授，博士。E-mail：gl-gump@163.com

Li Juan,Wang Qiong,Guo Kan,Gan Lin

The Research Center for Preclinical Medicine,Sichuan Medical University，Luzhou 646000,Sichuan Province,China