兔動脈粥樣硬化改良模型的建立及其評價

劉洋，何春水

兔動脈粥樣硬化改良模型的建立及其評價

劉洋，何春水

（成都中醫藥大學附屬醫院血管外科，四川成都610072）

目的：通過球囊擴張兔左頸總動脈探討兔動脈粥樣硬化模型的建立及其評價。方法：48只家兔隨機分為四組：普通飼料喂養組(12只)：普通飼料每天50 g／Kg，飼養10周；高脂組(12只)：普通飼料適應性飼養2周后，高脂飼料每天50 g／Kg喂養8周后處死；傳統斑塊模型組(12只)：普通飼料適應性飼養2周后，在直視下分離左側頸總動脈，行球囊損傷術，然后結扎左頸總動脈遠心端，術后再喂養8周后處死；改良斑塊模型組(12只)：普通飼料適應性飼養2周后，在直視下分離左側頸總動脈，行球囊損傷術，然后用7-0絲線縫合破口，術后再喂養8周后處死，觀察實驗前后血脂、頸動脈直徑及其管壁形態變化。結果：與普通組相比，后三組均形成了高脂血癥。改良組造影提示造模成功。改良組內膜厚度相對于傳統組明顯增厚，而中膜厚度明顯變薄。結論：相對于傳統造模方法，改良法沒有破壞術側的血流狀態，能形成更為明顯的動脈粥樣硬化斑塊。

動脈粥樣硬化；兔；模型；球囊損傷

作為發病率高、嚴重影響人類健康的疾病，動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是心腦血管病的主要病理基礎，也是導致心梗、腦梗、壞疽和肢體功能喪失的主要原因[1]。但AS的發病機制目前并不清楚，探討其發病機制及治療措施的關鍵系建立合適的動脈粥樣硬化動物模型。自從1908年Ignatowski成功地制作了第一例AS家兔動物模型以后，國內外許多學者相繼改進并進行了大量的實驗研究，然其結果均不甚理想。本研究在前人研究基礎上，改進了傳統模型的造模方法，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性日本大耳白兔48只，月齡3～4月，體重2.5～3.5 Kg。由四川省醫學科學院實驗動物研究所生產供應部提供。合格證：SCXK川2004-14。動物級別：一級。

1.2 材料與設備

市購二甲苯、甲醛、95%乙醇、HE染料、石蠟等，北京博奧森生物技術有限公司提供的α-SMA多克隆抗體，4%多聚甲醛，膽固醇，Guerbet公司提供碘比醇。

主要實驗設備包括：全自動封閉式組織脫水機、病理組織漂烘儀、手術放大鏡、球囊導管、自動生化檢測儀等。

1.3 建模及分組

1.3.1 實驗動物的分組

分成4組：①普通飼料喂養組：12只，普通飼料每天50 g／Kg，飼養10周；②高脂飼料對照組：12只，普通飼料適應性飼養2周后，高脂飼料每天50 g／Kg喂養8周后處死。高脂飼料含有1%膽固醇、8%豬油和91%普通飼料；③傳統斑塊模型組：12只，普通飼料適應性飼養2周后，在直視下分離左側頸總動脈，行球囊損傷術，然后結扎左頸總動脈遠端，術后再喂養8周后處死；④改良斑塊模型組：12只，普通飼料適應性飼養2周后，在直視下分離左側頸總動脈，行球囊損傷術，然后用7-0絲線縫合破口，術后再喂養8周后處死。

1.3.2 改良組操作方法

經耳緣靜脈注射苯巴比妥鈉（30 mg/Kg）麻醉后依次消毒，沿頸前正中線，縱行剖開皮膚4～5 cm，依次分離皮下組織，游離左頸總動脈4～5 cm，用動脈夾阻斷遠近端血流，在其近心端用眼科剪做0.5 cm橫切口，逆行插入4F動脈鞘管，然后插入球囊導管(2.5 mm×20 mm)距切口約4 cm處，將球囊連接手動壓力泵，注入（50%碘比醇+50%生理鹽水）使球囊內壓力達到10個大氣壓，維持此壓力緩慢回拉球囊損傷頸總動脈內膜，損傷長度為3 cm；上述過程共3次。退出球囊導管和鞘管，繼而用7-0的絲線間斷縫合破口，松開動脈夾，恢復血供，檢查吻合口無狹窄，頸總動脈充盈好、搏動好后，局部沖洗慶大霉素、連續縫合皮膚。術前靜脈注射肝素0.1 IU/Kg抗凝。術后肌肉注射慶大霉素8 000單位預防感染及靜脈注射肝素0.1 IU/Kg抗凝，連續3 d。

1.4 觀察指標的檢測

第1周及第10周時采集兔耳正中動脈血液，檢測甘油三脂(TG)、膽固醇(CHOL)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。4組動物均于喂養10周后參考術前造模步驟，用8 mL碘比醇造影觀察造模血管粥樣斑塊情況，并計算出動脈內徑大小(以血管最狹窄處為標記)；處死取材，剪取靶血管段，放入4%多聚甲醛液中固定24 h以上，經梯度酒精脫水，二甲苯透明后，每份標本用石臘包埋，間斷均勻切片（厚度5μm），行HE染色及免疫組化檢測。

1.5 統計學分析

采用SPSS17.0統計軟件進行統計分析，所有數據以x±s表示，四組樣本之間的對比采用單因素等方差分析，P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

實驗過程中傳統斑塊組死亡1只，改良斑塊組死亡1只，傳統組一例術側血管形成血栓，共46只用于結果分析。

2.1 4組實驗動物血脂及頸動脈形態學對比（表1～表2，圖1）

2.1.1 組內對比

4組實驗動物喂養前后膽固醇濃度、甘油三酯濃度、低密度脂蛋白濃度均明顯增高（P＜0.05）；傳統組及改良組實驗前后頸動脈狹窄處直徑有明顯變化（P＜0.05），而普通組和高脂組變化不大（P＜0.05）。

2.1.2 組間對比

與正常組相比，其余三組血清血脂水平升高明顯，差異有統計學意義（P＜0.05）。造影結果提示改良組術前與術后有顯著差異，改良組與傳統手術組、高脂組術后均存在顯著差異；改良手術組泡沫細胞陽性面積比率和傳統組、高脂組、正常組均有顯著差異（P＜0.05）。

表1 實驗前后血清血脂水平及其變化

表2 4組實驗動物頸動脈形態參數對比

圖1 喂養10周后血管造影

2.2 頸總動脈形態變化的鏡下特點

四組實驗動物之間頸總動脈鏡下形態變化各不相同，其具體改變見圖2。

圖2 4組實驗動物頸總動脈形態特征（HE染色×400）

2.3 a-SMA在動脈壁的表達

相對于正常組和高脂組，傳統組與改良組內膜的陽性表達明顯增多，后二者之間又以改良組陽性表達更為顯著（圖3）。

圖3 4組實驗動物a-SMA在動脈壁的表達（HE染色400×）

3 討論

早在1908年，Ignatowski為發展AS的實驗性研究，便使用含膽固醇的飼料喂養家兔，制作了AS的動物模型。此后，國內外不少學者從AS的發病機制出發，相繼建立了不同動物的模型，其造模的動物有：大白兔、雞、鼠、豬和猴等[2-5]。

目前制作AS模型的方法主要包括：脂質浸潤、鈣超載、免疫刺激及內膜損傷等[6-8]。AS的發病機制傾向于“內皮損傷反應學說”，認為AS各種危險因素最終作用點，都在于啟動或加重動脈內膜損傷。AS病變的形成是在動脈內膜損傷后，炎癥-纖維增生性反應綜合所致。故而，有研究者主張，從動脈內膜損傷角度出發，建立AS模型，其中最多見的方法系直接機械損傷內膜。

LeVeen等[9]觀察到，球囊導管自股動脈插入髂動脈，以生理鹽水充盈球囊，向外反復多次抽拉，繼而再高膽固醇喂食8周后，家兔可出現明顯AS表現。這一方法也是廣大國內外學者所接受的主要手段，并廣泛用于頸總和胸腹主動脈的造模[10]。另外Fishman等[11]和張磊等[12]則發明并改進了血管空氣干燥術建模方法。這一方法系分離頸動脈后以動脈夾阻斷血流，使用頭皮針平行穿刺，沖洗出血液后接上氣流將內膜干燥化處理，然后注入生理鹽水，放開動脈夾恢復血流，這一模型數周高脂飲食后可出現明顯AS表現。球囊法造成內皮細胞的即刻剝脫，而空氣法并不會導致內膜剝脫，但二者均是比較成熟的造模方法。

自從1980年Block等報道[13]了血管成形術后家兔動脈形態學的變化，經皮冠狀動脈腔內成形術(PTCA)就成為復制AS再狹窄模型的經典方法。這種方法的核心思想為球囊在動物頸動脈插入內使用607.95～1013.25 kPa反復充盈，加上多次回拉撕裂甚至剝脫內膜以暴露基底膜，引發一系列的病理改變[14-15]。加上后續的高脂飲食便可復制動物模型。但是傳統的方法結扎遠端的血管，形成了血管遠端的死腔，破壞了其血流動力學，基于此，我們在這個實驗中將這個方法進行了改良：用7-0縫線間斷縫合切口，以維持兔頸總動脈血流動力學的原始狀態。血管造影測定出改良組血管狹窄程度更為明顯，HE染色能明顯觀察到相對于傳統組的纖維斑塊期，改良組是處于更為成熟的粥樣斑塊期，圖像分析儀測定的內膜增厚，中膜萎縮，泡沫細胞增多，改良組與傳統組相比均更為明顯，說明改良手術組所形成的AS模型更為典型。

在該改良法制作的模型中，我們通過血管縫合技術，將手術段的血管加以縫合，保證了球囊損傷頸動脈遠心端的血流動力學檢測，通過血管造影、病理學組織切片以及免疫組化檢測，均能驗證該模型獲得的頸動脈標本具有顯著的動脈粥樣硬化變化，與傳統模型組相比，觀察血流變化更準確，在此模型的基礎上還能更進一步的研究血流動力學的改變對AS的影響因素，更精確得深入觀察動脈粥樣硬化斑塊的動態變化規律。

在前人研究基礎上，我們使用血管縫合技術將手術段的血管加以縫合，則大大降低了傳統模型中血流動力學的改變對AS的影響，與傳統造模組相比，模型方式更符合生理模式。在實驗動物模型建立的實驗中，高脂飼養中死亡1只，球囊損傷手術操作中未發生死亡，總的存活率在85%以上。球囊損傷與血管吻合操作時間在30 min左右，實驗新西蘭兔從麻醉到完全蘇醒在60 min內，與傳統造模組相比，手術造模時間延長不多，實驗兔死亡率相仿。故實驗操作性強，新西蘭兔的手術屈從性佳，方便可行。

本實驗建立的動脈粥樣硬化模型達到了以下要求：①狹窄血管局部的病理改變達到成熟的纖維斑塊期，與人類典型的粥樣硬化病變已很接近；②病變血管明顯狹窄，以內膜增厚為主；③能用臨床最常用、最可靠的方法——動脈血管造影來檢測和評價狹窄程度、部位和范圍；④模型建立的周期較短，僅兩個月；⑤選取家兔作為實驗動物，其解剖結構與人接近，動物大小和血管口徑具有較好的可操作性，而且動物來源充足，動物購買和飼養費用相對低廉。因此，該方法建立的AS動物模型，適合在實驗研究中推廣應用。

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（2015-03-23收稿）

Establishment and evaluation of a modified athesclerotic plaque model in rabbits

Liu Yang，He Chunshui
Departmentof Vascular Surgery，the Affiliated Hospitalof Chengdu University of T.C.M

Objective：To establish and evaluate a modified athesclerotic plaque model in rabbits.Methods: Forty eight rabbits were randomly divided into four groups:Normal food group(No.12):feeding with normal food 50 g/Kg for 10 weeks；High-fat group(No.12):after 2 weeks of ordinary food for adaptatian，high-fat food 50 g/ Kg for 8 weeks，then sacrificed.Traditional plague group(No.12)：after ordinary food for adaptation 2 weeks，under direct vision，the left common carotid artery，was isolated，balloon injury and ligation were performed，after operation，feeding for 8 weeks then sacrified.Modified plaque model group（No.12）:ordinary feeding 2 weeks，under the directvision isolated the left common carotid artery，performed balloon injury，and then using 7-0 silk thread to suture the crevasse.feeding 8 weeks then sacrificed Blood lipid，the carotid artery diameter and morphological change were observed before and after the experiment.Results：Compared with normal food group，hyperlipidemia were formed in the rest three groups.Angiography confrmed the success of the establisment of the modified model.Thickness of the intima was more obvious in improved group than in the traditional group，and the film thickness of tunica media was obviously thinner.Conclusion：Compared with traditional building method，the improved method can form more obvious atherosclerotic plaque without damage to blood flow.

Atherosclerosis;Rabbit;Models;Balloon injury

R543.5

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2015.04.023

劉洋（1979-），男，主治醫師，碩士，E-mail：zjobliu@163.com