基于國產18F多動能模塊的3-脫氧-3-[18F]氟代胸苷的快速自動化合成*

劉楠，萬強，陳躍

基于國產18F多動能模塊的3-脫氧-3-[18F]氟代胸苷的快速自動化合成*

劉楠，萬強，陳躍

（四川醫科大學附屬第一醫院核醫學科，四川瀘州646000）

目的：利用國產18F多功能合成模塊，摸索更優的18F-FLT合成方法，為臨床提供一種簡單，快速的全自動合成18FFLT的方法。方法：首先用無水正己烷清洗Sep-Pak QMA柱，再以四乙基碳酸氫銨為相轉移催化劑將18F-淋洗至反應管，以3-N-t-叔丁氧羰基-1-[5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧-3’-O-(4-硝基苯磺酰基-β-1)-蘇戊呋喃糖]胸腺嘧啶為前體，經親核、水解、中和三步反應后利用Sep-Pak小柱分離制備得到18F-FLT注射液。結果：成功利用全自動方法合成了18FFLT，總時間為25～30 min，未校正收率為10%～15%，放化純與化學純均大于95%，18F-FLT與19F-FLT在分析型HPLC上的保留時間為14.3 min，通過TLC檢測，Rf約為0.7。結論：發展了一種可靠的，簡單有效的18F-FLT合成方法，該方法提供了一種快速的18F離子干燥法，并通過Sep-Pak小柱純化獲得高放化純與化學純的18F-FLT注射液。

18F-FLT；柱純化；自動化合成；放射合成

正電子斷層掃描是一種在腫瘤診斷，分期以及治療方面非常有效的手段。雖然18F-FDG是目前應用最廣泛的腫瘤顯像劑,但其對腫瘤缺乏特異性，所以在臨床應用中仍有諸多的不足[1]。18F-FLT(3’-deoxy-3’-[18F]fluorothymidine是一種胸腺嘧啶核苷類似物，是目前臨床上使用最多的一類反映細胞增殖的正電子顯像劑。18F-FLT在體內的顯像原理與18F-FDG類似，在增殖細胞內，18F-FLT通過胸苷激酶-1（TK-1）磷酸化為([18F]FLT-5’-PO4，進而滯留并在細胞內積聚，而腫瘤細胞具有快速增殖的特點，因此18F-FLT能夠反映細胞增殖情況，對于腫瘤的早期診斷、鑒別診斷、療效監測及預后等方面具有重要的價值，并且在部分疾病的診斷上（例如：肺癌和腦瘤）具有比18F-FDG更高的診斷準確率[2]。

考慮到18F-FLT在臨床上的重要意義，因此有必要建立一些高效可靠的合成方法以滿足臨床需要。自從1991年首次報道18F-FLT的合成以來[3]，研究人員就不斷對其合成方法進行改進。但是，傳統的18F-FLT的合成仍面臨諸多問題，比如合成時間長（多為60 min左右），后處理復雜等（需要通過半制備HPLC進行純化）。

18F-FLT的制備主要涉及到18F-的捕獲、洗脫、親核反應與后處理。在過去的幾十年，研究主要集中于新型前體的研發與親核反應的條件改進[4-6]，但對于反應前的除水干燥階段以及反應后處理階段的研究還不多，而這兩個過程在整個標記反應中會用掉20～30 min，這也是導致放射活性大量損失的主要原因之一（18F-的半衰期為109.7 min）。考慮到完全的除水干燥不易掌握以及半制備HPLC柱子上產品吸附較多等問題[7-8]，近年來研究人員為進一步提高反應效率，縮短合成時間，也逐漸對這兩個過程重視起來。研究發現[8-10]，通過使用無水有機溶劑清洗QMA小柱，再使用含有相轉移催化劑的有機溶劑將18F-從QMA小柱上洗脫，可以有效的縮短除水時間，利用此法已成功合成18F-FDG，18F-FDR等多種18F示蹤劑。而對于反應的后處理，國內的文富華等[11]利用Sep-Pak SCX小柱，Sep-Pak Al2O3小柱與Sep-Pak C18小柱成功實現了18F-FLT的快速純化，雖然放化純＞95%，但張錦明[12]等發現其化學純并不令人滿意。2014年，有學者[13-14]通過增加洗脫劑的極性，成功獲得了高放化純與化學純的18F-FLT注射液。本研究嘗試利用國產18F多功能模塊，通過縮短除水時間，采用柱分離純化法純化產品，探索高效快速合成18F-FLT的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

H218O：豐度95%，德國ABX產品；無水乙腈；無水正己烷；四乙基碳酸氫銨（TEABC）：美國Sigma公司產品；Sep-Pak QMA；Sep-Pak Al2O3柱；Sep-Pak IC-H柱；Sep-Pak C18柱：美國Waters公司產品；NBoc前體：江蘇華益化工有限公司產品；NaOH和HCl：均為國產試劑。SIEMENS Eclipse HP/RD回旋加速器：德國西門子公司產品；MF-2V氟多功能合成模塊：派特(北京)科技有限公司產品，配有放射性檢測器、半制備HPLC、UV IS200紫外分光光度計(Alltech公司)；半制備HPLC柱Grace Alltima C-18 (250 mm×10 mm)；分析型HPLC與TLC檢測器：Lab Alliance高效液相色譜儀系統（天津蘭博公司）

1.2 國產18F多功能模塊的準備（圖1）

圖1 18F-FLT合成路線圖

本工作采用的國產18F多功能模塊雖然含有18F-FLT的合成程序，但為了適應本項研究，需要對模塊管線重新進行連接。首先將B的液體輸出端與A瓶連接并在前端連接單向閥，避免氣體倒灌入B瓶，將V17閥與中轉瓶連接起來，在V15閥與V17閥之間依次連接Sep-Pak IC-H柱與Sep-Pak Al2O3柱，V22閥與V23閥之間連接Sep-Pak C18小柱。

1.3 試劑準備

在18F-從加速器傳入模塊之前，首先將各種所需試劑加入到試劑瓶中。A瓶：5 mL無水正己烷；B瓶：10 mg TEABC溶解于1 mL無水乙腈中；C瓶：10 mg N-boc FLT前體溶解于0.6 mL無水乙腈中；D瓶：1 mL 1N HCl溶液；E瓶：1 mL 1N NaOH溶液；F瓶：5 mL H2O；G瓶：5 ml H2O；H瓶：10 mL 2%乙醇溶液；I瓶：10 mL 10%乙醇溶液。Sep-Pak QMA柱先用10mL 5%NaHCO3溶液清洗，再用10 mL水洗；Sep-Pak C18柱：先用10 mL乙醇清洗，再用10 mL H2O洗；Sep-Pak IC-H與Sep-Pak Al2O3柱：各用10 mL H2O清洗。

1.418F-FLT合成方法

國產氟多功能合成模塊合成18F-FLT的合成線路見示意圖1，合成流程見示意圖2。18F-離子被QMA捕獲后，無水正己烷清洗QMA，再將18F-洗脫至反應管，以3-N-t-叔丁氧羰基-1-[5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧-3’-O-(4-硝基苯磺酰基-β-1)-蘇戊呋喃糖]胸腺嘧啶脫氧核苷(N-BOCFLT)為前體，乙腈為溶劑，105℃下反應5 min，經酸水解，堿中和兩步后，反應液最后通過Sep-Pak小柱分離純化，再經無菌濾膜得到18F-FLT注射液。

圖2 國產18F多功能合成模塊合成示意圖

2 實驗方法

2.118F-FLT自動化合成步驟

①18F-由180(p,n)18F反應制備，傳輸并被QMA捕獲；②用5 mL無水正己烷清洗QMA，液體經V10轉移至廢液瓶，100℃干燥反應管1；③將B瓶中的洗脫液轉移至A瓶，淋洗QMA將18F-洗脫至反應管1，100℃蒸發除去乙腈至干；④加入C瓶前體，105℃下密閉反應5 min，其間兩次短暫打開V9與V3，將管線中的液體吹回反應瓶；⑤加入D瓶中的HCL溶液，在90℃下水解反應5 min；⑥冷卻反應管，加入E瓶中的NaOH溶液進行中和反應；⑦反應液經反應管2，Sep-Pak IC-H，Sep-Pak Al2O3柱轉移至中轉瓶，再由中轉瓶通過Sep-Pak C18柱轉移至廢液瓶：⑧將G瓶中的5 mL H2O加入到反應管2中，并重復步驟⑦；⑨將H瓶中的10 mL 2%乙醇溶液加入到中轉瓶，并通過Sep-Pak C18柱轉移至廢液瓶；⑩I瓶中的10 mL 10%乙醇溶液經Sep-Pak C18柱將產品通過無菌濾膜轉移至產品瓶，即獲得無色、透明的18F-FLT注射液。

2.218F-FLT的質量控制

①HPLC測定：Alltime C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，流動相為乙醇-水，體積比為8∶92；流速0.8 mL/min，流動相用放射性檢測儀以267 nm UV檢測。②TLC測定：將產品點樣于硅膠板上，以95%的乙腈溶液為展開劑展開。③18F-FLT的穩定性測定：采用HPLC分析法，分別于第2、4、6 h分析產品的放化純。

3 結果

本文通過對反應除水干燥過程與純化處理兩個部分的優化，改進了18F-FLT的自動化合成方法。該方法合成18F-FLT的總時間＜30 min，放射化學產率為10%～15%（未衰減校正n=3），放射化學純度與化學純度均＞95%（圖3），TLC檢測Rf≈0.7（圖4），室溫放置6 h，未見18F-FLT分解，能滿足常規臨床需要。我們在選用國產18F多功能模塊的前提下，使用目前生產效率較高的N-Boc FLT為前體進行研究。

圖3 18F-FLT純化后的HPLC分析圖

圖4 18F-FLT純化后的TLC分析圖

3.118F-洗脫過程影響因素探討

從目前18F-FLT的合成方法來看，使用的洗脫劑主要為相轉移催化劑K222與K2CO3的乙腈水溶液，個別使用季銨鹽的乙腈水溶液，但采用此種溶劑進行除水干燥時，所用時間＞12 min，并且高溫除水時間越久，18F-損失越多，再考慮到18F-的半衰期較短（僅為109.7 min），因此本研究采用無水甲醇與無水正己烷/乙腈兩種體系沖洗與淋洗QMA。結果顯示，當沖洗液與淋洗液均以無水甲醇為溶劑時，18F-洗脫效率僅為50%；采用無水正己烷沖洗QMA，再用含相轉移催化劑的乙腈淋洗QMA時，18F-洗脫效率約為90%。首次沖洗QMA時，有機溶劑的量應不少于5 mL，將QMA上的水充分除盡。由于國產18F多功能模塊不能將用于除水的有機溶劑直接轉移至廢液瓶，而是通過反應管1轉出，考慮到18F-FLT的合成對溶劑中的含水量要求較高，所以我們在將18F-洗脫至反應管后仍將乙腈蒸干，避免因管線里水導致反應失敗。

該方法主要優點如下：①除水干燥時間＜5min；②使用季銨鹽（TEABC）代替毒性較大的K222。

3.2 柱純化條件的優化

由于反應中存在過量的前體以及大量的副產物，雖然常規的半制備HPLC純化法能較為容易的將這些雜質除去，但耗時長（15～30 min）、產品吸附多，因此使用幾種不同的Sep-Pak小柱來純化（耗時3～5 min，吸附少），是目前研究的主要方向。我們首先采用文富華[11]等的方法來進行產品純化，結果顯示，18F-不能被完全除盡，并且張錦明[12]等對該實驗的研究發現18F-FLT的化學純度并不令人滿意。在本研究中，我們采用低濃度的乙醇溶液進行產品純化，首先固定反應的TEABC為10 mg，N-Boc FLT前體10 mg，105℃密閉親核5 min，待反應完成后轉移至Sep-Pak小柱進行純化。

由于模塊在使用過程中用到兩根反應管，產品附著較多，所以我們首先用5 mL水將反應管中附著的產品轉移至三根小柱上，隨后我們分別考查了5 mL、10 mL與15 mL的2%的乙醇溶液對Sep-Pak C18柱的清洗效果，結果發現當洗脫劑為5 mL時，終產品中的放化純為90%，化學純為85%，而洗脫劑為10 mL與15 mL時，終產品18F-FLT的放化純與化學純均大于95%。最終我們確定采用10 mL 2%的乙醇溶液沖洗Sep-Pak C18小柱，再用10%的乙醇溶液將產品淋洗進無菌真空瓶，即得18F-FLT注射液。

4 結論

利用國產18F多功能合成模塊，我們發展了一種快速，簡單可靠的18F-FLT制備方法，在研究中，我們采用無水正己烷來清洗QMA并且使用Sep-Pak小柱對產品進行分離純化，和其它18F-FLT合成工藝相比，該方法縮短了反應時間，簡化了反應過程，并獲得了高放化純與化學純的18F-FLT注射液，該法易于實現18F-FLT自動化合成，目前我們正在努力提高18F-的洗脫效率以及開展進一步的質量控制研究，以便該法生產的18F-FLT在臨床中推廣應用。

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（2015-03-31收稿）

Rapid automated synthesis of 3’-deoxy-3’-[18F]fluorothymidine based on a domestic18F multi-function module

Liu Nan，Wan Qiang，Chen Yue
Departmentof Nuclear Medicine，the First Affiliated Hospitalof Sichuan Medical University

Objective：To providea simple rapid automated method of synthesis of18F-FLT by using domestic18F multi-function module for clinical need.Methods:First,Sep-Pak QMA cartridge was rinsed with anhydrous methanol,then the trapped18F-was eluted into the reaction vessel with tetraethylammonium bicarbonate as phase transfer catalyst.With 3-N-t-butoxycarbonyl-1-[5’-O-(4,4’-dimethoxytriphenylmeth-yl)-2’-deoxy-3’-O-(4-nitrobenzenesulfonyl)-β-D-threopentofuranosy]thymine as the precursor molecule,the18F-FLT injection was eventually prepared by nucleophilic reaction,hydrolysis,neutralization,and purification withSep-Pak cartridge. Results：The automated synthesis of18F-FLT was successfully completed with the total synthesis time of about 25～30 min.the uncorrected yield was between 10%and 15%,and both the radiochemical purity and chemical purity were greater than 95%.The retention time of18F-FLT and19F-FLT on the analytical HPLC was 14.3 min and the Rf value was about 0.7 according to TLC analysis.Conclusion：A reliable,simple and efficient method of preparation of18F-FLT has been developed,which provides an efficient and rapid drying method for18F-.and through Sep-Pak cartridge purification to obtain18F-FKT injection of high radioch evical purity and chemical purity.

18F-FLT;Sep-Pak purification;Automated synthesis;Radiosynthesis

R817

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2015.04.007

*四川省科技廳-瀘州市政府-瀘州醫學院聯合科研專項基金項目（編號：14ZC0062）

劉楠（1983-），男，講師，博士

陳躍（1968-），男，教授，碩士，E-mail：chenyue5523@126.com