水飛薊賓體外抑制MCF—7細(xì)胞的增殖和TGF—β誘導(dǎo)的侵襲轉(zhuǎn)移

林峰 佟鑫 陳志杭

[摘要] 目的 探討水飛薊賓對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7生長(zhǎng)及侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用。 方法 將人乳腺癌細(xì)胞MCF-7用不同濃度的水飛薊賓處理后，采用MTT法檢測(cè)水飛薊賓對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用；用transwell技術(shù)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞在TGF-β培養(yǎng)體系中水飛薊賓對(duì)細(xì)胞侵襲力的影響； Western blot檢測(cè)腫瘤侵襲力相關(guān)蛋白MMP9和vimentin的表達(dá)。 結(jié)果 培養(yǎng)48 h后，50 μmol/L水飛薊賓組對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制率為（7.5±1.2）%，100 μmol/L水飛薊賓組對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制率為（24.6±2.8）%，150 μmol/L水飛薊賓組對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制率為（47.5±4.8）%， 200 μmol/L水飛薊賓組對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制率為（65.5±5.2）%；對(duì)照組穿過transwell膜的MCF-7細(xì)胞數(shù)為（119.4±25.7）個(gè)，TGF-β組穿過transwell膜的MCF-7細(xì)胞數(shù)為（401.6±48.5）個(gè)，100 μmol/L水飛薊賓+TGF-β組穿過transwell膜的MCF-7細(xì)胞數(shù)為（264.4±31.3）個(gè)；Western blot實(shí)驗(yàn)表明水飛薊賓可降低MMP9和vimentin的表達(dá)。 結(jié)論 水飛薊賓抑制人乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移。

[關(guān)鍵詞] 水飛薊賓；MCF-7；TGF-β；腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移

[中圖分類號(hào)] R735.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）17-0001-03

乳腺癌的發(fā)生率和死亡率僅次于肺癌，而在女性群體中是發(fā)生率最高的惡性腫瘤，它的高轉(zhuǎn)移性使之目前仍無法治愈[1]，對(duì)于中晚期不能進(jìn)行手術(shù)治療的患者，藥物治療是首選的治療方法，因此發(fā)展新的乳腺癌的治療藥物具有十分重要的意義。水飛薊賓（Silibinin），是水飛薊素（Silymarin）中最主要的生物活性成分，主要從植物奶薊（Silybum marianum）中提取，臨床上主要用于保肝護(hù)肝[2]。近些年來，水飛薊賓還被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性，對(duì)于多種腫瘤如結(jié)腸癌、乳腺癌等均具有良好抑制作用[3，4]，然而其對(duì)人乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用卻很少報(bào)道。因此，作者通過研究水飛薊賓對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的生物效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)水飛薊賓可以抑制乳腺腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

RPIM-1640培養(yǎng)基購于Gibco公司；胎牛血清購于杭州四季青生物工程有限公司；transwell小室購于美國康寧公司；水飛薊賓、二甲亞砜、噻唑藍(lán)（MTT）購于美國Sigma公司；β-actin、MMP9、vimentin抗體購自美國Cell signal公司；ECL試劑盒購于美國pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 本實(shí)驗(yàn)從2013年5月開始至2014年12月為止。人乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞系購于ATCC（American Type Culture Collection，美國模式培養(yǎng)物研究所），培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基中，含10%胎牛血清，100 U/L青霉素和100 mg/mL鏈霉素，培養(yǎng)環(huán)境為37℃恒溫且通入5%的CO2。

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn) 將MCF-7細(xì)胞按2×103/孔接種于96孔板，加入200 μL含10% FBS的RPIM-1640培養(yǎng)，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并分別加入0、50、100、150、200 μmol/L的水飛薊賓培養(yǎng)24、48、72 h，加5 mg/mL MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清，往孔中加150 μL DMSO，震蕩使紫色絮狀物完全溶解，570 nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=（OD對(duì)照組-ODsilibinin）/OD對(duì)照組×100%。

1.2.3 腫瘤細(xì)胞侵襲試驗(yàn) 在transwell小室中接種1×104個(gè)MCF-7細(xì)胞置于24孔板中，上室培養(yǎng)基為無血清RPMI-1640培養(yǎng)基并加入2 ng/mL TGF-β及100 μmol/L水飛薊賓，下室培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI-1640。培養(yǎng)24 h后取出transwell小室，用生理鹽水洗去小室內(nèi)的細(xì)胞，將transwell膜用3%多聚甲醛固定15 min后用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，低倍鏡（100×）觀察4個(gè)隨機(jī)選擇的區(qū)域，計(jì)算細(xì)胞總數(shù)。

1.2.4 Western blot試驗(yàn) 收集細(xì)胞，將細(xì)胞裂解后將蛋白提取液用12.5%的丙烯酰胺進(jìn)行SDS-PAGE，之后將凝膠取下將蛋白轉(zhuǎn)膜到PVDF膜（Millipore，USA）上。將膜在兔抗人MMP9或兔抗人vimentin一抗稀釋液中孵育過夜，之后再帶HRP酶活性的羊抗兔IgG二抗稀釋液中孵育2 h，ECL試劑顯色曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行作圖，用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行處理，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，P值計(jì)算采用非配對(duì)雙邊t檢驗(yàn)以及單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 水飛薊賓對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的體外抑制作用

水飛薊賓對(duì)MCF-7細(xì)胞有良好的體外抑制作用，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明隨著水飛薊賓濃度的增加，作用的時(shí)間的延長(zhǎng)，水飛薊賓的體外抗乳腺癌效果越明顯，說明水飛薊賓對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷呈劑量和時(shí)間依賴性，結(jié)果見表1、圖1。

2.2 水飛薊賓抑制TGF-β誘導(dǎo)的腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移

在TGF-β培養(yǎng)體系中加入水飛薊賓培養(yǎng)24 h后，穿過transwell膜的MCF-7細(xì)胞數(shù)目顯著下降（P<0.05），表明水飛薊賓有體外抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用。見表2。

2.3 水飛薊賓下調(diào)MCF-7細(xì)胞MMP9和vimentin的表達(dá)

在TGF-β培養(yǎng)體系中加入水飛薊賓培養(yǎng)24 h后，MCF-7細(xì)胞的MMP9和vimentin的表達(dá)相比于未加水飛薊賓組顯著下降，提示水飛薊賓抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能是下調(diào)腫瘤細(xì)胞MMP9和vimentin的表達(dá)水平。見圖2。

3 討論

水飛薊賓有十分廣泛和強(qiáng)烈的藥理活性，如水飛薊賓能抑制腫瘤細(xì)胞DNA的合成，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡等，對(duì)包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤均有十分良好的治療作用[5]。然而，水飛薊賓抗腫瘤的具體機(jī)制至今仍不十分清楚，需要更多的實(shí)驗(yàn)研究。在本研究中，為了證實(shí)水飛薊賓有體外抗乳腺癌作用，作者用從低劑量到高劑量的水飛薊賓處理乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，發(fā)現(xiàn)水飛薊賓確實(shí)有顯著的體外抗乳腺癌的藥理活性，且處理時(shí)間越長(zhǎng)、濃度越高，其對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用越明顯，表明水飛薊賓對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用呈劑量和時(shí)間依賴性。

乳腺癌致死率高的一個(gè)重要原因是乳腺癌細(xì)胞很容易發(fā)生轉(zhuǎn)移[6]，因此提高乳腺癌5年存活率的一個(gè)重要靶點(diǎn)就是抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。癌細(xì)胞屬于上皮細(xì)胞來源，然而在腫瘤發(fā)展過程中腫瘤細(xì)胞逐漸失去上皮細(xì)胞特征并獲得間充質(zhì)細(xì)胞特性，這一過程稱之為上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型（EMT）[7]。EMT是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過程，是腫瘤的發(fā)展和致死的關(guān)鍵因素[8]。在EMT過程中，腫瘤微環(huán)境中的TGF-β是重要的調(diào)節(jié)因子，腫瘤的侵襲能力依賴于TGF-β的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，當(dāng)TGF-β與Ⅱ型TGF-β受體結(jié)合后激活Ⅰ型TGF-β受體，Ⅰ型TGF-β受體是一種跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶，它能進(jìn)一步使轉(zhuǎn)錄因子Smads2和Smads3發(fā)生磷酸化激活，進(jìn)而上調(diào)間充質(zhì)細(xì)胞骨架蛋白如波形蛋白（vimentin）及基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP9）等促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲正常組織并發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移[9-11]。在本研究中，為了進(jìn)一步研究水飛薊賓是否能抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，作者將MCF-7細(xì)胞置于transwall上室中，并在上室培養(yǎng)基中加入適量TGF-β以模擬腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境。由于腫瘤在實(shí)際生長(zhǎng)過程中會(huì)由于營養(yǎng)供應(yīng)的限制，發(fā)生“饑餓”現(xiàn)象，因此上室培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基，而在下室培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清，腫瘤細(xì)胞會(huì)因此從低營養(yǎng)的上室往下室“遷移”[12]。

作者發(fā)現(xiàn)水飛薊賓加入MCF-7細(xì)胞的培養(yǎng)體系后，MCF-7的轉(zhuǎn)移能力受到顯著抑制。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明水飛薊賓不僅可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，更能抑制它們對(duì)周期組織進(jìn)行侵襲和轉(zhuǎn)移。為了研究水飛薊賓抑制MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的分子機(jī)制，作者將MCF-7細(xì)胞用飛薊賓處理后，用Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白vimentin和MMP9的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水飛薊賓能顯著降低乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白vimentin和MMP9的表達(dá)水平，提示水飛薊賓可能通過下調(diào)MMP9和vimentin的表達(dá)從而抑制TGF-β誘導(dǎo)的腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。

有文獻(xiàn)報(bào)道很多天然藥物具有十分顯著的抗腫瘤作用，并且有高效、低毒、高腫瘤選擇性的特點(diǎn)，有很大的研究?jī)r(jià)值[13，14]。水飛薊賓是一種天然藥物，在臨床上已經(jīng)大量應(yīng)用，證實(shí)了它的低毒低副作用特性，而本研究則發(fā)現(xiàn)水飛薊賓還具有十分良好的抗乳腺腫瘤細(xì)胞增殖的生物活性，此外，水飛薊賓還能顯著抑制TGF-β誘導(dǎo)的腫瘤侵襲效應(yīng)，表明水飛薊賓能減少乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，對(duì)乳腺腫瘤患者的預(yù)后起到十分積極的作用。這些研究提示了水飛薊賓可能在人乳腺癌治療中有廣闊的應(yīng)用前景。

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（收稿日期：2015-03-11）