補腎活血方對卵巢早衰小鼠顆粒細胞凋亡的影響

劉慧萍等

摘要：目的 探討補腎活血方抑制卵巢早衰（POF）小鼠卵泡顆粒細胞凋亡的作用機制。方法 以小鼠透明帶3為抗原，皮下多點注射免疫BALB/c雌性小鼠建立免疫性POF模型。取40只清潔級雌性小鼠，隨機分為空白組、模型組、陽性藥組、補腎活血方組。補腎活血方組給予補腎活血方藥液灌胃，陽性藥組給予戊酸雌二醇藥液灌胃，模型組和空白組給予等量生理鹽水灌胃，2次/d，連續15 d。取卵巢、子宮、胸腺進行稱重，計算其臟器指數；HE染色觀察顆粒細胞凋亡情況；采用放射免疫法檢測雌二醇（E2）、促黃體生成激素（LH）和促卵泡生成激素（FSH）的水平；采用RT-PCR分析卵巢顆粒細胞中Fas、Fas-L mRNA表達情況。結果 與空白組比較，模型組卵巢、胸腺、子宮質量和E2水平顯著降低（P<0.05，P<0.01），FSH、LH水平和Fas、Fas-L mRNA表達顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，給藥組顆粒細胞凋亡明顯減少，卵巢指數、子宮指數、胸腺指數增加（P<0.05），E2水平升高（P<0.01），FSH、LH水平及Fas、Fas-L mRNA表達明顯降低（P<0.05，P<0.01）。結論 補腎活血方可調節下丘腦-垂體-卵巢軸的激素水平，通過降低Fas、Fas-L的mRNA表達抑制細胞凋亡。

關鍵詞：補腎活血方；卵巢早衰；顆粒細胞；細胞凋亡；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.014

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）04-0047-04

Effects of Bushen Huoxue Prescription on Granulosa Cell Apoptosisi of Premature Ovarian Failure Mice LIU Hui-ping， XIAO Yi， LI Ling， QI Peng， SONG Yan， LI Jia-jun， YI Hai-qing， KE Chao， ZHANG Guo-min （Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China）

Abstract：Objective To discuss Bushen Huoxue Prescription mechanism of action on follicular granulosa cell apoptosis of premature ovarian failure （POF） mice. Methods The mouse zona pellucida 3 as the antigen， multi-point injection of subcutaneous immunization BALB/c to female mice was used to establish autoimmune POF model. Forty clean female mice were randomly divided into blank group， model group， Estradiol Valerate group and Bushen Huoxue Prescription group. All medicine groups were given relevant medicine for gavage， while model and blank groups were given normal saline with the same amount for gavage for 15 days. After the treatment， ovary， uterus， and thymus were weighed， and the viscera index was calculated. An ovarian slice was taken and HE staining was used to observe granulosa cell apoptosis. The levels of E2， LH， and FSH were detected by using the radioimmunoassay method. RT-PCR was used to analyze Fas and Fas-L mRNA expressions in ovarian granulosa cells. Results Compared with blank group， the weight of ovary， thymus， and uterus decreased significantly （P<0.05， P<0.01）；Serum E2 level dropped （P<0.01）；levels of FSH and LH， and expressions of Fas and Fas-L mRNA increased significantly （P<0.01）. Compared with model group， granulosa cell apoptosis significantly decreased， and ovary index， uterus index， and thymus index increased （P<0.05）；serum E2 level

基金項目：國家自然科學基金（81303123）；中國博士后科學基金（2013T60770、2012M511382）；高等學校博士學科點專項科研基金（20114323120007）；湖南省重點實驗室開放基金（2014XNFZ06）；湖南省大學生創新訓練中心資助項目（2013年）；湖南省重點學科-中西醫結合基礎（2012年）；湖南中醫藥大學重點學科-病理學及病理生理學（2012年）

通訊作者：張國民，E-mail：834095773@qq.com

increased （P<0.01）；levels of FSH and LH， and expressions of Fas and Fas-L mRNA significantly decreased （P<0.05）. Conclusion Bushen Huoxue Prescription can decrease expressions of Fas and Fas-L mRNA to inhibit cell apoptosis by adjusting the hormone level of hypothalamus-pituitary- ovarianaxis.

Key words：Bushen Huoxue Prescription；premature ovarian failure；granulose cell；cell apoptosis；mice

卵巢早衰（Premature ovarian failure，POF）是指婦女40歲以前出現閉經、雌激素缺乏、促性腺激素水平升高為特征的一種疾病。國外研究顯示，本病在40歲以前的婦女中發病率為1%～2%，30歲以前的婦女發病率為0.1%，20歲以前的發病率為0.01%[1-2]。該病可導致不孕、更年期癥狀提前、骨質疏松等并發癥，伴隨卵泡顆粒細胞出現核固縮、胞漿出現空泡、形成閉鎖小體等凋亡形態的改變。卵泡顆粒細胞在卵母細胞體內外成熟過程中起著重要的作用。研究表明，由生殖激素控制的顆粒細胞凋亡是直接控制卵泡排卵或閉鎖的重要因素[3]。本實驗觀察了補腎活血方對POF小鼠顆粒細胞凋亡的影響，并探討其作用機制，為研究卵巢細胞凋亡及人為控制卵泡的發育等提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物

40只清潔級健康雌性BALB/c小鼠，體質量18～22 g，7～8周齡，湖南中醫藥大學動物實驗中心提供，合格證號SCXK（湘）2011-0003。飼養于湖南中醫藥大學清潔級實驗動物中心，自由飲水和攝食。

1.2 藥物

補腎活血方由紫石英、補骨脂、菟絲子、熟地黃、生地黃、桑寄生、覆盆子、山萸肉、土鱉蟲、水蛭、雞內金、路路通、澤瀉、澤蘭、桔梗、烏藥、甘草組成。武火煮沸，文火煮40 min，過濾，重復煎2次，合并濾液，濃縮至2倍臨床等效劑量1.08 g/mL的無菌藥液。飲片購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院。戊酸雌二醇片，德國拜耳醫藥有限公司，批號J20130009，用溫開水溶解藥片，制成溶液，調整濃度為0.006 mg/mL。購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥房。

1.3 主要試劑與儀器

小鼠透明帶多肽溶液，小鼠透明帶3（ZP3）的第330-342個氨基酸序列（NSSSSQFQIHGPR），分析純度>90%，杭州中肽生化有限公司，批號P00105；弗氏完全佐劑，美國Sigma公司，批號F5881；弗氏不完全佐劑，美國Sigma公司，批號F5506；雌二醇（E2）、促黃體生成素（LH）、促卵泡生成素（FSH）放免試劑盒，批號08112O，購自北京科瑞美科技有限公司；總RNA提取試劑盒，批號092134，購自北京佰億新創科技有限公司；總RNA提取試劑盒，購自杭州博日科技有限公司。MP-120-2型電子天平（上海第二天平儀器廠）；LEICA DM LB2型雙目顯微鏡、LEICA RM2255全自動輪轉切片機（德國LEICA公司生產）。

1.4 造模與分組

取6 mg ZP3透明多肽粉末，加入6 mL雙蒸水配成溶液，與弗氏完全佐劑按1∶1配制成免疫試劑，與弗氏不完全佐劑按1∶1配制成免疫強化試劑。每日上午9點，參考文獻[4]方法，每只小鼠給予0.15 mL免疫試劑注射雙后腳掌處及腹腔皮下，14 d后以免疫強化試劑0.15 mL再次注射雙后腳掌處及腹腔皮下加強免疫，建立免疫性POF模型。空白組每次造模時每只小鼠予0.15 mL生理鹽水注射雙后腳掌處及腹腔皮下。取40只清潔級雌性小鼠，隨機分為空白組、模型組、陽性藥組、補腎活血方組，每組10只。補腎活血方組以2倍臨床等效劑量（1.08 mL/20 g）補腎活血方藥液灌胃，陽性藥組給予0.4 mL/20 g戊酸雌二醇藥液灌胃，模型組和空白組給予等量生理鹽水灌胃，均2次/d，連續15 d。

1.5 指標檢測

1.5.1 臟器指數檢測 眼球取血后，脫頸處死動物，摘取卵巢、子宮、胸腺組織稱重，計算臟器指數（臟器指數=臟器質量/體質量）。

1.5.2 病理形態學觀察 取卵巢稱重后，加入4%多聚甲醛溶液中固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片，脫蠟，常規HE染色，做病理切片。觀察卵巢內正常卵泡和閉鎖卵泡的形態變化。

1.5.3 雌二醇、促黃體生成激素和促卵泡生成激素檢測 眼球取血，并迅速離心分離出血清，采用放射免疫法檢測血清中E2、FSH、LH的含量。

1.5.4 Fas、Fas-L基因表達檢測 取卵巢組織勻漿，用RNA試劑盒提取mRNA，采用RT-PCR檢測顆粒細胞中Fas、Fas-L mRNA表達。

1.6 統計學方法

采用SPSS18.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，成組設計資料采用t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 補腎活血方對小鼠臟器指數的影響

與空白組比較，模型組卵巢、胸腺、子宮指數顯著降低（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，陽性藥組、補腎活血方組卵巢、胸腺、子宮指數升高（P<0.05）；與陽性藥組比較，補腎活血方組小鼠卵巢、胸腺指數升高（P<0.05），子宮指數無明顯變化。見表1。

2.2 補腎活血方對小鼠雌二醇、促黃體生成素和促卵泡生成素水平的影響

與空白組比較，模型組E2水平降低，FSH、LH水平升高（P<0.01）；與模型組比較，補腎活血方組、陽性藥組E2水平升高，FSH、LH水平均降低（P<0.01）；與陽性藥組比較，補腎活血方組E2水平升高，FSH、LH水平降低（P<0.05）。見表2。

2.3 補腎活血方對小鼠卵巢形態學及顆粒細胞凋亡的影響

鏡下觀察模型組卵巢體積縮小，卵巢皮質內見少量初級卵泡及生長卵泡，黃體數量少，閉鎖卵泡多，可見較多間質、纖維血管、間質腺，顆粒細胞凋亡明顯，數量明顯減少；補腎活血方組卵巢皮質內見大量初級卵泡及生長卵泡，較多近成熟卵泡，黃體數多，黃體生長良好，顆粒細胞凋亡明顯少于模型組。見圖1。

2.4 補腎活血方對小鼠卵巢中Fas、Fas-L mRNA表達的影響

Fas、Fas-L mRNA灰度分析結果見圖2。與空白組比較，模型組Fas、Fas-L mRNA表達水平顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，補腎活血方組Fas、Fas-L mRNA表達水平降低（P<0.05）。

3 討論

卵巢早衰在中醫學中無專門記載，可歸屬于“血枯”“血隔”“閉經”等范疇。其病因病機主要為腎虛胞阻，治療原則主要是補腎通絡。補腎活血方由湖南中醫藥大學尤昭玲教授經長期臨床實踐組方，主治腎虛胞阻型卵巢早衰[5-6]。該方配伍嚴謹，用藥精當，既符合中醫組方特色，又依據現代醫學方法，切中病機，以達補腎通絡之功效。本病是腎陰、腎陽同時虛損所致，故方中重用紫石英溫補腎陽，熟地黃平補腎陰，兩藥共為君藥；補骨脂、菟絲子、生地黃、桑寄生、山萸肉、覆盆子合用為臣藥，使腎陰得養、腎陽得化；澤瀉、澤蘭、生雞內金、路路通、土鱉蟲、水蛭走沖任而活血利水通胞絡，祛瘀通滯；桔梗、烏藥條暢氣機，使氣血沖任通暢，月經順時而下，利于卵子排出，二者合用為佐藥；甘草調和諸藥為使。現代藥理研究表明，紫石英、補骨脂等補腎藥有類激素樣作用，能改善POF引起的雌激素分泌不足，提高子宮內膜的容受性，改善宮頸黏液的分泌，利于精子通過[7]。補腎陽藥可增強黃體功能，利于早期妊娠。活血化瘀藥可使血管擴張，改善器官的血流量和高凝狀態，穩定子宮和輸卵管的內環境。因此，補腎藥與活血化瘀通絡藥配伍有利于調經和助孕，是將中西病理、病機、藥理融會貫通，也正是該方的靈魂所在。 實驗結果顯示，補腎活方可使卵巢和胸腺質量增加，卵巢指數上升，發育成熟卵泡較多，卵泡顆粒細胞層增多，卵巢間質淋巴細胞及漿細胞浸潤減少。而顆粒細胞是卵巢周期激素合成的主要部位，表明補腎活血方的療效機制是促進顆粒細胞合成，分泌E2并釋放入血，發揮生物學效應，促進卵泡、子宮發育，使子宮、卵巢質量增加。胸腺是機體的免疫器官，經治療后，各組胸腺指數均上調，胸腺細胞數量增加，使胸腺細胞發育過程中，對自身抗體應答的細胞被消除或抑制，從而形成對自身抗原的耐受性。由此可見，補腎活血方能調節和改善機體的免疫功能，但其作用機制有待進一步研究。

細胞凋亡的發生受多種基因表達的調控，以Fas/Fas-L系統為代表的死亡受體信號轉導途徑是其中的重要途徑[8-9]。Fas是細胞表面重要的死亡受體，與其配體Fas-L結合后活化并傳導凋亡信號，從而誘導表達Fas的靶細胞凋亡[10]。研究結果顯示，模型組Fas mRNA表達明顯高于正常組；與模型組比較，補腎活血方組Fas mRNA表達水平降低。表明Fas/Fas-L通路的激活可能是顆粒細胞凋亡的重要機制。本實驗研究表明，補腎活血方對藥物造成的卵巢早衰具有一定療效，通過提高E2，降低LH、FSH的激素水平和抑制Fas、Fas-L基因的表達，從而改善卵泡顆粒細胞的凋亡來發揮作用。

參考文獻：

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（收稿日期：2014-11-09）

（修回日期：2014-11-25；編輯：華強）