健脾活骨方不同提取部位對骨髓間充質干細胞增殖和分化的影響

李曉敏 孔祥英 張村 萬紅葉 朱嘉 陳衛衡 林娜

摘要：目的 觀察健脾活骨方不同提取部位對體外培養大鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs）增殖及成骨、成脂分化的影響，對其健脾作用的有效部位進行初步篩選。方法 采用全骨髓貼壁篩選培養法分離BMSCs，給予健脾活骨方不同提取部位（水、氯仿、正丁醇和乙酸乙酯萃取部位）作用一定時間后，MTS法檢測細胞增殖，堿性磷酸酶（ALP）染色檢測ALP活性，茜素紅（ARS）染色檢測鈣結節的形成，油紅O染色檢測脂肪細胞的形成。結果 健脾活骨方不同提取部位均能不同程度促進BMSCs的增殖，其強度依次為水、氯仿、正丁醇和乙酸乙酯部位；ALP染色結果顯示，促進ALP表達的強度依次為水、乙酸乙酯、氯仿和正丁醇部位；ARS染色結果顯示，促進鈣結節的形成作用強度依次為水、氯仿、正丁醇和乙酸乙酯部位；油紅O染色結果顯示，抑制脂肪細胞形成的作用強度依次為乙酸乙酯、水、氯仿和正丁醇部位。結論 健脾活骨方不同提取部位對BMSCs增殖和分化的影響不同，水部位促進增殖和成骨分化作用最強，乙酸乙酯抑制脂肪細胞形成作用最佳。

關鍵詞：健脾活骨方；骨髓間充質干細胞；細胞增殖；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.018

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）07-0063-05

Effects of Different Extracts of Jianpi Huogu Formula on Proliferation and Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells LI Xiao-min1， KONG Xiang-ying1， ZHANG Cun1， WAN Hong-ye1， ZHU Jia2， CHEN Wei-heng2， LIN Na1 （1.Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；2.Wangjing Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100102， China）

Abstract：Objective To observe effects of different extracts of Jianpi Huogu Formula （JPHGF） on proliferation and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cell （BMSCs）. Methods Whole bone marrow adherent was used to screen， culture， and isolate BMSCs. Extracts from different parts （water， chloroform， ethyl acetate and n-butanol parts） of JPHGF were administrated for a certain time. MTS was used to detent cell proliferation；ALP staining was used to detect ALP activity；ARS staining was used to detect the formation of calcium nodules；oil red O staining was used to detect fat cell formation. Results Extracts from different parts of JPHGF could promote cell proliferation of BMSCs in different levels， followed by its strength in water， chloroform， ethyl acetate， and n-butanol parts；ALP staining results showed that the intensity of ALP expression of the order is water， acetic acid ethyl， chloroform and n-butanol parts；in promoting the formation of calcium nodules， ARS staining results showed that its intensity were water， chloroform， ethyl acetate， and n-butanol parts；oil red O staining results showed that inhibition intensity of fat cells interaction strength was formed from ethyl acetate， water， chloroform to n-butanol parts. Conclusion Extracts from different parts of JPHGF have different effects on BMSCs proliferation and differentiation. Water extraction has the strongest osteogenic differentiation and proliferation， and ethyl acetate has the best effect on the inhibition of cell formation.

Key words：Jianpi Huogu Formula；BMSCs；cell proliferation；rats

基金項目：國家自然科學基金面上項目（81173417）

通訊作者：林娜，E-mail：linna888@163.com

股骨頭壞死是由多種原因引起股骨頭供血障礙而導致的骨細胞及骨髓成分死亡及隨后修復的病理過程，是骨傷科的一種常見難治性疾病。近年來研究顯示，激素性股骨頭壞死的發生與骨髓間充質干細胞（BMSCs）成骨和成脂分化失衡相關[1]。BMSCs是成骨細胞和成脂細胞的共同的前體細胞源，即在一定條件下，既可以向成骨也可以向脂肪細胞分化。BMSCs向成骨細胞與脂肪細胞分化的平衡維系著髓內骨組織與脂肪組織量的平衡，BMSCs成骨分化與成脂分化互為“倒數”關系，一旦BMSCs過多地向脂肪細胞分化，則向成骨細胞分化的細胞數相應減少，進而引起成骨缺陷。健脾活骨方（JPHGF）是中國中醫科學院望京醫院陳衛衡主任醫師治療早中期股骨頭壞死的臨床經驗方，臨床療效良好[2]。為了進一步明確其藥效物質基礎，本研究觀察其不同提取部位（水、氯仿、正丁醇和乙酸乙酯萃取部位）對大鼠BMSCs增殖、成骨和成脂分化的影響，為臨床應用和新藥研發提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級SD大鼠，雄性，4周齡，體質量80～100 g，解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK-（軍）2012-0004。分籠飼養，室溫20～24 ℃，濕度60%～70%，自由飲水飲食，明暗周期12 h/12 h。

1.2 主要試劑與儀器

L-DMEM，Hyclone；BMSCs培養基、BMSCs成脂分化培養基，ScienCell；地塞米松、β-磷酸甘油、L-抗壞血酸，Sigma；戊酸雌二醇（E2），法國拜爾公司；MTS，Promega；0.25%胰酶，Gibco；BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒，碧云天生物技術研究所；茜素紅（ARS）、油紅O染液，Sigma。生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司），倒置顯微鏡（重慶光電儀器有限公司），CO2培養箱（上海力申科學儀器有限公司），MK3型全自動酶標儀（Thermo公司）。

1.3 藥物

健脾活骨方藥物組成：茯苓15 g，桂枝10 g，甘草6 g，麩炒白術15 g，法半夏10 g，黨參20 g，當歸10 g，川芎10 g，熟地黃15 g，赤芍12 g，鹿角膠（烊化）20 g，土鱉蟲10 g。飲片購自北京同仁堂藥店。

2 實驗方法

2.1 健脾活骨方不同萃取部位制備

按處方比例稱取飲片，10倍量水煎煮2次，每次1 h，合并水煎液，濃縮液60%乙醇沉淀，靜置48 h，離心，取上清液，減壓濃縮。鹿角膠以適量熱水烊化后并入上述濃縮液中，混勻后以系統溶劑萃取分離，分別得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水萃取部位。用L-DMEM培養液制成含原藥材1 g/mL的藥液，稀釋成100 mg/mL儲存液，備用，-20 ℃保存。

2.2 骨髓間充質干細胞分離與培養

大鼠脫頸處死，浸于75%乙醇中，剪開大腿內側，剝離皮膚和肌肉，暴露股骨和脛骨，浸于75%乙醇中，無菌條件下剪開股骨和脛骨兩端，使骨髓腔暴露，用含有10%血清的BMSCs培養基，沖洗骨髓腔3遍，細胞篩過濾，接種于25 cm2培養瓶中，放入5%CO2、95%空氣、37 ℃、飽和濕度孵箱培養，待細胞長至80%～90%融合時，0.25%胰酶消化，傳代，3～5代細胞用于后續實驗。

2.3 骨髓間充質干細胞增殖水平檢測

取第3～5代BMSCs，0.25%胰酶消化成單細胞懸液后，4×103個/孔密度接種于96孔板。待細胞長至60%～70%時，加不同濃度JPHGF的不同提取部位（終濃度分別為10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2 mg/mL），將加入同體培養基孔設為對照組。48 h后每孔加MTS 20 ?L，繼續培養4 h，在酶標儀波長492 nm處測吸光度（OD值）。

2.4 骨髓間充質干細胞成骨誘導分化

選擇第3～5代BMSCs，4×103個/孔密度接種于96孔板中，細胞貼壁生長24 h后，換為成骨誘導培養基（含10%胎牛血清，0.1 μmol/L地塞米松，50 μmol/L L-抗壞血酸，10 nmol/L β-磷酸甘油的L-DMEM）進行誘導培養，并同時給予不同濃度JPHGF的不同提取部位（終濃度分別為10-6、10-5、10-4 mg/mL），將加入同體培養基孔設為對照組。每3 d換液1次。

2.5 堿性磷酸酶染色

細胞成骨誘導第7日時進行堿性磷酸酶（ALP）染色。棄培養基，PBS沖洗2遍，4%多聚甲醛固定15 min， PBS沖洗2遍，加BCIP/NBT染色液，避光反應10 min，鏡下觀察并采集圖片。每孔加入200 μL PBS避光反應15 min，在酶標儀405 nm處檢測其OD值。

2.6 茜素紅染色

細胞成骨誘導第14日時進行ARS染色。棄培養基，PBS沖洗2遍，4%多聚甲醛固定15 min，PBS沖洗2遍，加ARS染色液，避光反應10 min，鏡下觀察并采集圖像。10%氯化十六烷基吡啶37 ℃洗脫15 min，在酶標儀595 nm處檢測其OD值。

2.7 骨髓間充質干細胞成脂誘導分化

選擇第3～5代BMSCs，4×103個/孔密度接種于96孔板中，細胞貼壁生長24 h后，換為MADM進行成脂誘導分化，同時給予不同濃度JPHGF的不同提取部位（終濃度分別為10-6、10-5、10-4 mg/mL），將加入同體培養基孔設為對照組。每3 d換液1次。

2.8 油紅O染色

細胞成脂誘導第14日時進行油紅O染色。棄培養基，PBS沖洗2遍，4%多聚甲醛固定15 min，PBS沖洗2遍，加入油紅O染色液，避光反應10 min，鏡下觀察并采集圖像。100%異丙醇在37 ℃洗脫15 min，595 nm處檢測其OD值。

3 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，組間計量資料比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 健脾活骨方不同提取部位對骨髓間充質干細胞增殖的影響

JPHGF 4種不同提取部位（水、氯仿、正丁醇和乙酸乙酯部位）對BMSCs的增殖均有顯著的促進作用，表現為OD值顯著增高，其中水和氯仿部位在10-6～10-2 mg/mL范圍內，呈明顯濃度依賴性（P<0.05，P<0.01，P<0.001）；而正丁醇部位在10-6～10-4 mg/mL范圍內，濃度依賴性較好，隨濃度增加，促增殖作用有所下降；乙酸乙酯部位的在10-6～10-2 mg/mL范圍內，量效關系不明顯。為比較各種提取物對BMSCs的效應，選擇10-6～10-4 mg/mL范圍作為觀察濃度，結果見圖1。

注：con為對照組；與con比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖1 JPHGF不同提取部位BMSCs增殖比較（492 nm）

4.2 健脾活骨方不同提取部位對堿性磷酸酶活性的影響

成骨分化培養基可以顯著促進ALP染色陽性細胞的產生，經定量檢測，JPHGF 4種不同提取部位對BMSCs增殖均有不同程度的促進作用，其中水和乙酸乙酯部位在10-6～10-4 mg/mL范圍內可以濃度依賴性地促進ALP的表達，其中水部位更顯著，在10-6 mg/mL即可顯著發揮促進作用（P<0.05）；氯仿和正丁醇部位觀察濃度范圍內，量效關系不顯著。結果見圖2。

注：A.ALP染色結果（×50），con為對照組，OI為成骨誘導組；

B.ALP染色定量統計（405 nm）。與con比較，###P<0.001；與OI比較，

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001（下同）

圖2 JPHGF不同提取部位BMSCs成骨分化ALP活性比較（405 nm）

4.3 健脾活骨方不同提取部位對骨髓間充質干細胞成骨分化中鈣結節形成的影響

為進一步驗證其結果，通過ARS染色觀察JPHGF不同提取部位對BMSCs成骨分化中鈣結節形成的影響。結果與ALP染色基本吻合，水和氯仿部位在10-6～10-4 mg/mL范圍內呈濃度依賴性地促進ALP表達，其中水部位更顯著，在10-6 mg/mL即可顯著發揮促進作用（P<0.05）；正丁醇和乙酸乙酯部位僅在10-4 mg/mL才發揮促進作用。結果見圖3。

4.4 健脾活骨方不同提取部位對骨髓間充質干細胞成脂分化的影響

油紅O為脂溶性染料，在脂肪內能高度溶解，可特異性的使三酰甘油等中性脂肪著色；因此，油紅O作為脂肪細胞的特異性染色方法。經成脂分化培養基誘導后，見橙紅色陽性顆粒。水和乙酸乙酯部位在10-6～10-4 mg/mL范圍內陽性細胞數降低（P<0.05，P<0.01），其中乙酸乙酯部位呈現有濃度依賴趨勢。氯仿和正丁醇部位作用不顯著。結果見圖4。

注：A.ARS染色結果（×50）；B.ARS染色定量統計（595 nm）

圖3 JPHGF不同提取部位BMSCs成骨分化中鈣結節比較

注：A.油紅O染色結果（×50）；B.油紅O染色定量統計（595 nm）；

AI為成脂誘導組，Sim為辛伐他汀組。與con比較，###P<0.001；

與AI比較，*P<0.05，**P<0.01

圖4 JPHGF不同提取部位BMSCs成脂分化比較

5 討論

股骨頭壞死屬中醫“骨蝕”“骨痹”“骨痿”等范疇，病機主要為脾虛生痰，由痰致瘀，因瘀致痹。根據這一病機，以“痰瘀同治”為治則，以JPHGF用于治療早中期非創傷性股骨頭壞死，取得良好療效[3-4]。前期實驗研究表明，JPHGF可有效調節脂代謝，明顯降低實驗性股骨頭壞死動物的骨髓腔脂肪細胞面積和空骨陷窩率，發揮顯著的股骨頭壞死防治作用[5-6]。然而，該方的藥效物質基礎尚不清楚，這在一定程度上影響了對其作用機制的認識和進一步的新藥研究開發。

近年來，有學者采用BMSCs移植治療股骨頭缺血性壞死，取得較好的療效[7]。但BMSCs移植治療的安全性、有效性、載體的選擇等問題還有極大的限制性，而內源性BMSCs的調控則顯示其優越性。因此，藥物對于內源性BMSCs的調節成為目前抗股骨頭壞死研究的靶點。我們前期研究顯示，JPHGF可以抑制成脂關鍵因子PPARγ以及調控Wnt3a/LRP5/β-catenin信號通路[8]。基于此，本實驗通過建立體外BMSCs增殖和分化研究平臺，根據藥物組成及臨床應用情況，選擇水、氯仿、正丁醇和乙酸乙酯萃取部位的制備方法，對JPHGF發揮股骨頭壞死防治作用有效部位進行初步的篩選，并探討其可能的機制。

實驗結果顯示，JPHGF不同提取部位對BMSCs增殖、成骨及成脂分化均有一定的影響，但作用強度不同，其中水部位可以濃度依賴性地促進BMSCs增殖和成骨分化，抑制成脂分化；乙酸乙酯部位可以顯著抑制成脂分化，還可以明顯促進成骨分化；氯仿提取部位促進BMSCs增殖方面作用比較突出，而氯仿和正丁醇提取部位對成骨和成脂分化的調節作用均不顯著。也就是說，水提取部位在促進BMSCs增殖和成骨分化方面較優，而乙酸乙酯提取部位則重在抑制成脂分化方面。究其原因可能與不同溶劑分離部位的化學物質組成存在明顯差異相關，本研究結果初步提示，以水提取部位綜合作用最佳，為不同提取方式側重不同的治療方向給予一定的提示。

參考文獻：

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[2] 陳衛衡，周宇，何海軍，等.健脾活骨方治療早中期非創傷性股骨頭壞死的前瞻性臨床研究[J].中華關節外科雜志，2013，7（3）：3-8.

[3] 鄒海鵬，陳衛衡.中晚期股骨頭壞死中醫綜合治療的臨床研究[J].北京中醫藥，2010，29（1）：43-45.

[4] 陳衛衡，劉道兵，孫凱，等.股骨頭壞死中醫證型與相關理化指標關系的研究[J].中國骨傷，2006，18（9）：513-516.

[5] 田能，孔祥英，萬蓉，等.健脾活血方對激素性股骨頭壞死血管內皮生長因子表達的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2010，16（2）：48-51.

[6] 萬蓉，林詩富，林娜，等.不同治法方藥對激素性股骨頭壞死的骨組織形態學影響[J].中國骨傷，2010，22（12）：915-919.

[7] Tang QQ， Lane MD. Adipogenesis：from stem cell to adipocyte[J]. Annual Review of Biochemistry，2012，81：715-736.