PPAR-γ和P38MAPK蛋白在肝細胞癌中的表達及臨床意義

張 萌 彭 利 喬治斌 何洪濤 周 燁 梁占強 徐 卓

(河北醫科大學第四醫院肝膽外科，河北 石家莊 050011)

過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)與惡性腫瘤的關系及其配體的治療作用正受到廣泛的關注，研究發現PPAR-γ配體具有抑制腫瘤細胞生長、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成及降低腫瘤侵襲力等作用，此類作用與PPAR-γ激活后參與調控多條細胞內信號傳導通路有關〔1〕。P38MAPK通路是絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族的重要成員，受細胞外信號的刺激而激活，通過磷酸化下游轉錄因子，參與細胞的增殖、分化和凋亡〔2〕。有研究發現PPAR-γ激活后可經P38MAPK通路誘導腎癌細胞的凋亡〔3〕，但二者在肝細胞癌的研究甚少。本實驗采用免疫組織化學方法檢測肝癌組織及正常肝組織中PPAR-γ和P38MAPK蛋白的表達，分析其與肝細胞癌臨床病理特征的關系及相互關系，探討其在肝細胞癌中表達的意義及其預后價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集河北醫科大學第四醫院肝膽外科2007年1月至2010年3月手術切除并經病理證實的隨訪資料完整的肝細胞癌標本57例。所有患者術前均未經過任何抗腫瘤治療。其中男51例，女6例，年齡34～75歲，中位年齡57歲。標本切除離體立即固定于10%中性甲醛溶液，石蠟包埋。57例肝細胞癌組織中，27例直徑≤5 cm，30例直徑＞5 cm;侵及鄰近臟器或淋巴結轉移共11例，未侵及鄰近臟器或無淋巴結轉移46例;有門靜脈瘤栓7例，無門靜脈瘤栓50例;47例為單發腫瘤，10例為肝內多發腫瘤。臨床分期根據TNM分期，Ⅰ期1例，Ⅱ期23例，Ⅲ期32例，Ⅳ期1例。另取肝血管瘤患者之肝組織20例作為對照。由兩位有經驗病理醫師進行病理組織學診斷。

1.2 主要試劑 PPAR-γ(E-8)鼠抗人單克隆抗體及P38MAPK(H-147)兔抗人單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司。即用型非生物素免疫組化EliVisionTMsuper檢測試劑盒(KIT-9922)、即用型快捷免疫組化MaxVisionTM2試劑盒(KIT-5920)均購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3 免疫組織化學染色方法 采用免疫組織化學一步法(EliVisionTMsuper試劑盒)檢測標本。切片均用2%APES處理，4μm連續切片。橘櫞酸鹽緩沖液進行抗原熱修復。PPAR-γ和P38MAPK抗體均以1∶100稀釋。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照;PPAR-γ的陽性對照為已知陽性的乳腺癌切片;P38MAPK的陽性對照為已知陽性的胰腺癌切片。

1.4 結果判定 PPAR-γ蛋白陽性染色集中于細胞核，少數為胞核、胞質均著色，呈棕黃色至深棕色粗顆粒狀。參照文獻〔4〕判定標準，陽性細胞所占比例＜10%者為陰性，陽性細胞所占比例≥10%者為陽性。P38MAPK蛋白陽性表達為細胞質和細胞核內出現棕黃色顆粒。根據文獻〔5〕綜合細胞染色強度及陽性細胞所占百分率進行評分，每張切片細胞的著色程度得分和著色細胞的百分率得分相乘，即為陽性系數。陽性系數≤2分為低表達，陽性系數＞2為高表達。

1.5 隨訪情況 隨訪所有病例均有完整隨訪資料，研究自手術之日起，至本研究結束(2013-1-1)止，隨訪時間單位為月，研究終點(陽性結局)定義為患者因肝癌或相應并發癥死亡，研究結束時仍未出現陽性結局者定為刪失。隨訪時間1.0～71.1個月，中位隨訪時間為27.2個月。

1.6 統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行χ2檢驗及Fisher確切概率計算法;相關分析采用Spearman相關分析，生存分析采用Kaplan-Meier生存曲線，并經Log-rank檢驗。

2 結果

2.1 PPAR-γ蛋白在肝細胞癌組織中的表達與臨床病理特征的關系 PPAR-γ蛋白在57例肝細胞癌組織中的陽性表達率(45.6%)顯著高于正常肝組織(15.0%)(P＜0.05，見圖1)。PPAR-γ蛋白在門靜脈癌栓組的陽性表達率顯著高于無門靜脈癌栓組(P＜0.05);PPAR-γ蛋白的陽性表達率在TNM分期各組之間差異顯著，分期越晚陽性率越高(P＜0.05)。PPAR-γ蛋白表達在患者年齡、性別、腫瘤數目、腫瘤直徑、有否轉移各組之間差異無統計學意義(P＞0.05，表1)。

PPAR-γ蛋白陽性表達組的 1、3、5年生存率分別為53.8%、42.3%、0.0%;陰性表達組的1、3、5年生存率分別為54.8%、48.4%、39.9%;兩組間差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.2 P38MAPK蛋白在肝細胞癌組織中的表達與臨床病理特征的關系 57例肝細胞癌組織中P38MAPK蛋白的高表達率為64.9%，顯著高于正常肝組織(14.3%，P＜0.05，見圖1)。但P38MAPK蛋白高表達在患者年齡、性別、門靜脈癌栓、腫瘤數目、腫瘤直徑、TNM分期、有否轉移各組之間差異無統計學意義(P ＞0.05，表1)。

P38MAPK蛋白高表達組的 1、3、5年生存率分別為67.7%、45.5%、43.1%;低表達組的 1、3、5 年生存率分別為42.5%、39.2%、0%;兩組間差異無統計學意義(P＞0.05)。

表1 PPAR-γ與P38MAPK蛋白在肝細胞癌中的表達與臨床病理特征的關系〔n(%)〕

圖1 PPAR-γ與P38MAPK蛋白在不同組織中的表達 (IHC，×200)

2.3 PPAR-γ和P38MAPK蛋白在肝細胞癌組織中的表達相關性 在肝細胞癌組織中PPAR-γ蛋白與P38MAPK蛋白表達呈明顯正相關(r=0.378，P=0.004)。

3 討論

近年研究發現PPAR-γ在多種惡性腫瘤組織中表達上調。在胃癌組織中，PPAR-γ表達顯著高于胃黏膜異型增生及慢性萎縮性胃炎，且與淋巴結轉移和組織分化程度無關，提示PPAR-γ 的高表達是胃癌發生的早期事件之一〔4〕;Wang等〔6〕研究發現PPAR-γ表達上調在正常食管組織向巴雷特食管和食管癌發展的過程中發揮重要作用。本實驗結果說明PPAR-γ蛋白的陽性表達與肝癌的發生、發展、侵襲、轉移有密切關系，PPAR-γ蛋白有可能為患者的不良預后提供參考;但是經Kaplan-Meier生存分析顯示PPAR-γ蛋白的表達與肝癌患者預后無關，進一步擴大樣本量或延長隨訪時間有可能得出陽性結論。Giaginis等〔7〕在65例胰腺癌組織中發現49例(75%)PPAR-γ蛋白表達陽性，并且與腫瘤分期、直徑和預后有關，認為PPAR-γ可以作為胰腺癌的獨立預后因素。

MAPKs家族是細胞內主要的信號轉導系統之一，可將胞外刺激信號傳遞到細胞核，從而參與和調控細胞的多種生理病理過程〔8〕。其中P38MAPK主要參與細胞應激反應和炎癥反應，但近年來研究發現其參與調節腫瘤細胞的增殖和凋亡，并且在腫瘤發病、耐藥、轉移中也起重要作用〔9〕。P38MAPK在許多人類腫瘤，如乳腺癌、胃癌、前列腺癌等呈普遍持續的過度表達。我們的研究發現，P38MAPK蛋白在肝細胞癌組織中的表達顯著上調，同國內學者徐正府等〔10〕的研究結果一致。但是本研究發現，P38MAPK的過度表達與肝細胞癌的臨床病理特征無關，與患者的預后無關，提示P38MAPK通路可能主要在肝細胞癌形成的早期發揮作用，磷酸化P38MAPK為其活性形式，致癌因素等細胞外信號磷酸化激活P38MAPK通路后，其再作用于多種轉錄因子，通過調控下游基因發揮生物細胞學效應〔11〕。而且目前研究證實，P38MAPK激活后導致的效應具有細胞類型依賴性和刺激類型依賴性，即不同細胞在受到不同刺激影響時，P38MAPK所導致的最終結果可能是完全不同的〔12〕。

本實驗結果說明在肝細胞癌的發生和發展過程中二者存在密切聯系。Fujita等〔3〕研究發現，曲格列酮與PPAR-γ結合后可通過激活P38MAPK通路在體外誘導腎癌細胞的凋亡，并引發細胞的G2/M期阻滯。國內學者劉加軍等〔13〕的實驗顯示，PPAR-γ與配體結合后可誘導白血病HL-60細胞的凋亡，并認為這與p38MAPK通路及 caspase-3的激活有關。PPAR-γ與P38MAPK蛋白在肝細胞癌中的高表達與其被激活后發揮的抑癌作用之間有何聯系，其具體機制如何，有待進一步研究明確。

1 Reka AK，Goswami MT，Krishnapuram R，et al.Molecular cross-regulation between PPAR-γand other signaling pathways:implications for lung cancer therapy〔J〕．Lung Cancer，2011;72(2):154-9.

2 del Barco Barrantes I，Nebreda AR.Roles of p38 MAPKs in invasion and metastasis〔J〕．Biochem Soc Trans，2012;40(1):79-84.

3 Fujita M，Yagami T，Fujio M，et al.Cytotoxicity of troglitazone through PPARγ-independent pathway and p38 MAPK pathway in renal cell carcinoma〔J〕．Cancer Lett，2011;312(2):219-27.

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5 Lee SD.Immunohistochemical analysis of nuclear factor，p38，and cyclin D1 proteins in premalignant lesions and carcinomas of the colorectal mucosa〔J〕．Korean JGastroenterol，2008;52(6):359-67.

6 Wang W，Wang R，Zhang Z，et al.Enhanced PPAR-gamma expression may correlate with the development of Barrett＇s esophagus and esophageal adenocarcinoma〔J〕．Oncol Res，2011;19(3-4):141-7.

7 Giaginis C，Katsamangou E，Tsourouflis G，et al.Peroxisome proliferatoractivated receptor-gamma and retinoid X receptor-alpha expression in pancreatic ductal adenocarcinoma:association with clinicopathological parameters，tumor proliferative capacity，and patients＇survival〔J〕．Med Sci Monit，2009;15(5):148-56.

8 Keshet Y，Seger R.The MAP kinase signaling cascades:a system of hundreds of components regulates a diverse array of physiological functions〔J〕．Methods Mol Biol，2010;661:3-38.

9 De la Cruz-Morcillo MA，Valero ML，Callejas-Valera JL，et al.P38MAPK is a major determinant of the balance between apoptosis and autophagy triggered by 5-fluorouracil:implication in resistance〔J〕．Oncogene，2012;31(9):1073-85.

10 徐正府，任雪霞，黃介飛，等.MMP-13及P38MAPK在肝細胞癌侵襲和轉移中的作用〔J〕．蘇州大學學報(醫學版)，2008;28(6):966-9.

11 Kim EK，Choi EJ.Pathological roles of MAPK signaling pathways in human diseases〔J〕．Biochim Biophys Acta，2010;1802(4):396-405.

12 劉 瑞，高維娟.絲裂原活化蛋白激酶信號通路及其在細胞凋亡中的作用〔J〕．中國老年學雜志，2012;32(18):4089-92.

13 劉加軍，徐 妍，劉文迭，等．環格列酮通過PPARr及P38MAPK信號途徑誘導白血病HL-60細胞凋亡〔J〕．中華醫學雜志，2010;90(32):2270-4.