番茄紅素解除PM2.5暴露內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷

陳文生 孫燦興 戴建威

(廣州醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)系，廣東 廣州 511436)

PM2.5主要來源是人為排放〔1〕，能對呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)造成傷害〔2〕，長期暴露于PM2.5中人群心血管事件發(fā)生和死亡風(fēng)險顯著升高〔3〕。對比于嬰兒、青年，PM2.5對老年人的健康影響最大〔4〕，其可能是影響社區(qū)老年人健康的主要污染物〔5〕。番茄紅素是成熟番茄的色素，屬烴類胡蘿卜素〔6〕，是強力抗氧化生物活物質(zhì)〔7〕，對防治前列腺炎、前列腺癌、肺癌、胃癌、乳癌有奇效，對預(yù)防心腦血管疾病有顯著效果〔8〕。目前國內(nèi)對于番茄紅素的研究大多局限于分離純化方面。本實驗擬探討番茄紅素是否有解除PM2.5暴露下臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)氧化損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 HUVEC細(xì)胞購自美國模式菌種收集中心(ATCC)細(xì)胞庫;脂質(zhì)氧化丙二醛(MDA)檢測試劑盒、總超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒、八肽膽囊收縮素(CCK-8)試劑盒購自碧云天公司;人白細(xì)胞介素(IL)-6 ELISA試劑盒購自博士德公司;PM2.5顆粒物樣品于2013年6～11月于北京三環(huán)內(nèi)收集;番茄紅素購于Sigma公司;兔抗人缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α單克隆抗體、兔抗人β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔抗體購自博士德公司;qPCR檢測試劑盒購于TAKARA公司。

1.2 方法

1.2.1 最適番茄紅素濃度及作用時間 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，取穩(wěn)定生長的HUVEC細(xì)胞，以5 000個細(xì)胞/100μl的濃度接入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁伸展開后，設(shè)立4個實驗組，分別給予不同濃度番茄紅素(0、40、80、160μg/ml)刺激無 PM2.5暴露HUVEC細(xì)胞12、24 h;不同濃度番茄紅素刺激PM2.5暴露HUVEC細(xì)胞12、24 h。每組設(shè)3個復(fù)孔，加入CCK-8溶液后0.5 h測定OD值。PM2.5暴露濃度根據(jù)本實驗室已有結(jié)果80μg/ml為最佳刺激濃度進行實驗操作。

1.2.2 總SOD活性檢測 細(xì)胞接種后設(shè)立空白對照組、番茄紅素組、PM2.5組、番茄紅素+PM2.5組，每組2個復(fù)孔，實驗藥物作用濃度、時間依據(jù)最適番茄紅素作用濃度時間結(jié)果，選擇80μg/ml番茄紅素刺激24 h。實驗操作參照總SOD活性檢測試劑盒說明書進行。

1.2.3 檢測細(xì)胞MDA含量 細(xì)胞分組同1.2.2，每組3個復(fù)孔，實驗操作參照MDA檢測試劑盒說明書進行。

1.2.4 IL-6 mRNA表達情況 細(xì)胞分組同1.2.2，每組2個復(fù)孔，提取總 RNA，核酸定量儀檢測濃度，RT-PCR產(chǎn)物進行q-PCR，每組3個復(fù)孔。基因的引物均通過Primer Premier 6設(shè)計完成，由上海生工生物工程公司合成。IL-6上游引物:5'-TGAGAGTAGTGAGGAACAAG-3'，下 游 引 物:5'-CGCAGAATGAGATGAGTTG-3'。β-actin上游引物:5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下游引物:5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。qPCR總反應(yīng)體系20μl:SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)10μl、上下游引物各 0.4μl、ROX Reference DyeⅡ(50×)0.4 μl、DNA模板1μl，加入無菌雙蒸水至反應(yīng)總體積為20μl。在同一反應(yīng)體系對目標(biāo)基因和β-actin同時進行qPCR，預(yù)變95℃ 30 s，1 個循環(huán);PCR 反應(yīng)95℃ 5 s，60℃ 30 s，40 個循環(huán);溶解曲線分析 95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。

1.2.5 IL-6蛋白表達情況 細(xì)胞分組同1.2.2，實驗操作參照人IL-6 ELISA試劑盒說明書，每組3個復(fù)孔。

1.2.6 Western印跡檢測 HIF-1α蛋白表達 細(xì)胞分組同

1.2.2，提取細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定濃度，每泳道20μl總蛋白，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDSPAGE)凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶慢搖封閉3 h，孵育一抗、二抗，曝光結(jié)果采用Quantity One軟件分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件行單因素ANOVA分析。

2 結(jié)果

2.1 最適番茄紅素作用濃度、時間檢測 在PM2.5與番茄紅素共同作用下，12 h組別中細(xì)胞的OD值與濃度無依賴性，各組間OD值無顯著差異(P＞0.05);24 h組別中，PM2.5+0μg/ml番茄紅素組、PM2.5+80μg/ml番茄紅素組OD值分別與空白對照組OD值有顯著差異(P值分別為0.044，0.009 8)，得出80μg/ml番茄紅素作用下PM2.5造成的細(xì)胞毒性最小，作用最佳時間為24 h，后續(xù)實驗操作所用番茄紅素濃度都為80 μg/ml，PM2.5濃度都為80 μg/ml。見表1。

表1 番茄紅素濃度及處理時間優(yōu)化(x ± s，n=3)

2.2 SOD活性檢測 番茄紅素組SOD活性最大(0.105 2)，PM2.5組SOD活性最小(0.039 9)，空白對照組與番茄紅素+PM2.5組分別為0.054 6、0.059 1。番茄紅素組與番茄紅素+PM2.5組SOD活性對比，升高48.04%(P＜0.01);空白對照組、PM2.5組與PM2.5+番茄紅素組SOD活性無明顯差異(P＞0.05)。

2.3 MDA檢測 PM2.5組MDA含量(5.202)較番茄紅素+PM2.5組(3.179)顯著升高52.35%(P＜0.05);番茄紅素組MDA含量(1.734)較番茄紅素 +PM2.5組(1)顯著降低38.89%(P＜0.05)，空白對照組MDA含量(3.179)與番茄紅素+PM2.5組無明顯差異(P＞0.05)。

2.4 IL-6表達情況 PM2.5組細(xì)胞IL-6 mRNA表達量(1.8)較番茄紅素+PM2.5組(1)顯著升高80%(P＜0.01)，番茄紅素組細(xì)胞IL-6 mRNA表達量(0.75)較番茄紅素+PM2.5組顯著降低25%(P＜0.05)，空白組細(xì)胞IL-6 mRNA表達量(1.25)較番茄紅素+PM2.5組顯著升高25%(P＞0.05)。

空白對照組IL-6蛋白含量(4.592)與番茄紅素+PM2.5組(4.762)比較無明顯變化;番茄紅素組(4.293)較番茄紅素+PM2.5組降低9.8%(P＜0.05);PM2.5組含量(5.363)較番茄紅素+PM2.5組升高12.6%(P＞0.05)。

2.6 HIF-1α表達情況 番茄紅素組(0.553 1)較番茄紅素+PM2.5組(0.765 2)細(xì)胞的 HIF-1α表達量顯著降低27.7%(P＜0.05)，PM2.5組細(xì)胞的HIF-1α表達量(0.881 3)較番茄紅素+PM2.5組細(xì)胞的HIF-1α表達量顯著升高15.2%(P＜0.05)。空白對照組HIF-1α表達量為0.726 9。見圖1。

圖1 不同處理后HUVEC細(xì)胞HIF-1α條帶

3 討論

氧化損傷被認(rèn)為是引起癌癥和心腦血管疾病發(fā)病增加的主要原因之一，PM2.5對心腦血管損傷，尤其是對老年人的心腦血管損傷甚為嚴(yán)重。番茄紅素的體外抗氧化能力已得到許多實驗證實，其抗氧化作用是β-胡蘿卜素的2倍多，是維生素E的100倍〔9〕。自由基損傷的特點是破壞防御酶系統(tǒng)，大量消耗SOD，而SOD恰恰是機體清除自由基的重要抗氧化酶，是自由基損害的主要防御酶。脂質(zhì)過氧化作用參與了心肌缺血缺氧的過程。血清中SOD活性下降及過氧化脂質(zhì)代謝產(chǎn)物MDA含量顯著升高是反映心肌缺血缺氧程度的重要標(biāo)志〔10〕，本研究結(jié)果顯示，番茄紅素的抗氧化作用能解除因PM2.5暴露造成的細(xì)胞氧化損傷。此外，PM2.5對細(xì)胞有明顯的氧化作用，番茄紅素有較強的抗氧化作用和對PM2.5暴露的細(xì)胞有顯著的解除氧化損傷作用。

IL-6為炎癥細(xì)胞因子，機體氧化損傷后會引發(fā)炎癥，促使細(xì)胞產(chǎn)生和分泌炎癥細(xì)胞因子;同樣，HIF-1α是缺氧誘導(dǎo)因子，只有在缺氧條件下才可穩(wěn)定表達，其表達與缺氧適應(yīng)、炎癥發(fā)展及腫瘤生長等相關(guān)，因此，檢測IL-6和HIF-1α的表達量將從炎癥的角度解釋番茄紅素抗氧化作用的機制。本研究結(jié)果顯示PM2.5能使細(xì)胞IL-6表達顯著升高，同時，番茄紅素的作用能解除PM2.5上調(diào)IL-6表達的現(xiàn)象。IL-6變化后，細(xì)胞HIF-1α表達量隨后也發(fā)生了顯著變化，PM2.5能上調(diào)細(xì)胞HIF-1α的表達，而番茄紅素具有解除PM2.5上調(diào)HIF-1α表達的作用。

綜上，番茄紅素能通過IL-6/HIF-1α通路有效解除PM2.5暴露對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用，對于因暴露PM2.5而患心腦血管疾病的敏感群體老年人，番茄紅素可能有治療作用。

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