黃芩素對人膽囊癌細胞系SGC996細胞活力及細胞鋅指X染色體蛋白表達的干預作用

陳虹

黃芩素對人膽囊癌細胞系SGC996細胞活力及細胞鋅指X染色體蛋白表達的干預作用

陳虹

目的 探討中藥黃芩提取物黃芩素對人膽囊癌的生物效應及機制。方法 將人膽囊癌細胞系SGC996用黃芩素處理48h，采用MTT法檢測治療后SGC996的細胞活力；通過對透過transwell膜的SGC996細胞進行計數，評估黃芩素對膽囊癌侵襲轉移能力的影響；通過流式細胞術檢測黃芩素處理后，SGC996細胞的凋亡情況，并用Western blot方法檢測細胞鋅指X染色體蛋白（ZFX）的表達。結果 40、80、160、320μmol/L黃芩素組對SGC996細胞活力的抑制率與對照組比較，差異有統計學意義 [（19.3±3.8）%、（37.9±5.8）%、（61.6±7.8）%、（84.2±10.2）%比0，P＜0.05]。40、80、160μmol/L黃芩素組對SGC996細胞的凋亡誘導率與對照組比較，差異有統計學意義 [（7.5± 1.2）%、（16.3±1.9）%、（31.2±2.8）%比（0.5±0.5）%，P＜0.05]。40、80、160μmol/L黃芩素組對SGC996細胞轉移抑制率與對照組比較，差異有統計學意義[（25.6±6.6）%、（57.3±7.9）%、（84.1±11.9）%比0，P＜0.05]。Western blot結果顯示，黃芩素對ZFX有顯著的抑制作用。結論 黃芩素有良好的抗膽囊癌生物活性，其抗腫瘤效應的機制可能與下調ZFX蛋白表達有關。

人膽囊癌細胞系；SGC996；黃芩素；細胞鋅指X染色體蛋白；細胞活力

膽囊癌是一種惡性程度較高的消化系統腫瘤，具有腫瘤早期即發生淋巴結侵襲及遠端轉移的特征，較難治愈[1-2]。早期膽囊癌患者往往無癥狀或僅為輕微腹部不適，約90%的患者在確診為膽囊癌時已進入中晚期，失去手術機會[3]。因此，藥物治療是目前治療膽囊癌的主要手段。黃芩素是從天然藥物黃芩根部提取的主要活性成分，具有抗過敏，抗菌，抗病毒的功效，研究還發現黃芩素可能有抗腫瘤的作用[4]，因此本研究的目的在于探討黃芩素對膽囊癌的抗腫瘤效應及機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 人膽囊癌SGC996細胞系來源于上海中科院細胞庫，培養在DMEM培養基中，含10%胎牛血清，100U/L青霉素和100mg/mL鏈霉素，培養環境為37℃恒溫且通入5%的CO2。

1.2 實驗試劑 DMEM培養基購于美國Gibco公司。黃芩素，噻唑藍（MTT），AnnexinⅤ-FITC凋亡試劑盒購于美國Sigma公司。細胞鋅指X染色體蛋白（ZFX）抗體及β-actin抗體購于美國cell signaling公司。ZFX siRNA合成于廣州銳博生物有限公司。轉染試劑Lipofectamine 2000購于Invitrogen公司。BCA試劑盒和ECL試劑盒購于美國Pierce公司。

1.3 MTT試驗 將SGC996細胞按5×103個/孔接種于96孔板，加入200μL含10%胎牛血清的DMEM培養，設置3個復孔，并分別以10、20、40、80、160、320μmol/L的黃芩素培養48h，對照組為不加黃芩素同樣條件培養48h。之后加20μL 5mg/mL MTT培養4h。棄上清，往孔中加入150μL二甲亞砜，570nm波長下用酶標儀檢測OD值，細胞活力抑制率用以下公式計算：抑制率=（OD對照組-OD黃芩素組）/OD對照組×100%。

1.4 SGC996細胞侵襲轉移能力檢測 在transwell小室中接種1×104個SGC996細胞置于24孔板中，上室培養基為無血清DMEM培養基并分別加入40、80、160μmol/L黃芩素，下室培養基為含10%胎牛血清的DMEM培養基。培養48h后取出transwell小室，用生理鹽水洗去小室內的細胞，將transwell膜用3%多聚甲醛固定 15min后用 0.1%結晶紫染色20min，低倍鏡（100×）觀察4個隨機選擇的區域，計算細胞總數。SGC996細胞轉移抑制率用以下公式計算：抑制率=（對照組細胞數目-黃芩素組細胞數目）/對照組細胞數目×100%。

1.5 細胞凋亡試驗 SGC996細胞的凋亡采用Annexin V/PI染色法檢測。在SGC996細胞培養體系中分別加入40、80、160μmol/L黃芩素培養48h，對照組為不加黃芩素同樣條件培養48h，收集細胞，生理鹽水清洗一次，按照試劑說明書將PI和Annexin V加入細胞中孵育20min，用生理鹽水清洗3次后采用流式細胞術檢測腫瘤細胞的凋亡。細胞凋亡率用Annexin V陽性細胞占所有細胞比值表示。

1.6 Western blot試驗 在SGC996細胞培養體系中分別加入40、80、160μmol/L黃芩素培養48h，對照組為不加黃芩素同樣條件培養48h，細胞裂解后用BCA試劑盒進行定量，取50μg蛋白質在12.5%的丙烯酰胺中進行SDS-PAGE，之后將凝膠取下將蛋白轉膜到PVDF膜上。將膜在ZFX一抗或β-actin一抗中孵育過夜，之后在帶辣根過氧化物酶活性的二抗稀釋液中孵育2h，ECL試劑顯色曝光，于暗室中曝光X膠片，以ZFX與β-actin蛋白條的灰度比值表示蛋白的相對表達水平。

1.7 細胞轉染 ZFX siRNA序列為：正向：5'-ACAAGGAUCAAUUUCCGACUU-3'；反向：5'-GUCGGAAAUUGAUCCUUGUUU-3'。無關RNA序列為正向：5'-ACCGUGGAUAAUCACCAAUUU-3'；反向：5'-AUUGGUGAUUAUCCACGGUUU-3'。待SGC996細胞生長到80%密度時按Lipofectamine2000產品說明書要求將100nmol/L的ZFX siRNA或無關對照siRNA轉染入SGC996細胞中培養16h，之后換新鮮培養基并加入40μmol/L的黃芩素再培養48h，檢測細胞活力、凋亡水平和細胞轉移抑制率。

1.8 統計學方法 所有實驗重復3次，實驗數據用均數±標準差（±s） 表示，應用SPSS12.0統計軟件進行處理，采用非配對雙邊t檢驗以及單因素方差分析，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芩素對膽囊癌細胞系SGC996細胞活力的影響 MTT結果表明黃芩素在體外濃度達到40μmol/L以上時即顯示顯著的抗膽囊癌效應（P＜0.05），提示黃芩素對腫瘤細胞的殺傷作用且呈劑量依賴性，見表1。

表1 不同濃度黃芩素對SGC996細胞活力的影響（±s）

表1 不同濃度黃芩素對SGC996細胞活力的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05

對照組10μmol/L黃芩素組20μmol/L黃芩素組40μmol/L黃芩素組80μmol/L黃芩素組160μmol/L黃芩素組320μmol/L黃芩素組3 3 3 3 3 3 3 0 10 20 40 80 160 320 0 0.4±0.9 4.2±1.5 19.3±3.8* 37.9±5.8* 61.6±7.8* 84.2±10.2*

2.2 黃芩素對膽囊癌細胞系SGC996侵襲轉移能力及凋亡程度的影響 transwell實驗和凋亡檢測實驗表明黃芩素能顯著降低SGC996的轉移能力并誘導腫瘤發生凋亡（P＜0.05），見表2。

2.3 黃芩素下調膽囊癌細胞系SGC996ZFX蛋白表達 黃芩素可顯著下調SGC996ZFX蛋白的表達水平，見圖1。為了研究ZFX蛋白與黃芩素抗膽囊癌效應的關系，我們應用小RNA（siRNA）基因沉默技術，下調SGC996細胞的ZFX水平，并將40μmol/L黃芩素加入到細胞培養體系中，檢測ZFX基因沉默后黃芩素對SGC996細胞的抑制作用。結果發現單獨轉染ZFX siRNA也能抑制SGC996的細胞活力和轉移能力，并誘導細胞的凋亡，而ZFX siRNA聯合黃芩素則可發揮協同作用，顯著殺傷SGC996細胞，見表3。

表2 黃芩素體外對SGC996侵襲轉移能力及凋亡程度的影響（±s）

表2 黃芩素體外對SGC996侵襲轉移能力及凋亡程度的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別對照組40μmol/L黃芩素組80μmol/L黃芩素組160μmol/L黃芩素組孔數3 3 3 3黃芩素濃度（μmol/L）0 40 80 160轉移抑制率（%）0 25.6±6.6* 57.3±7.9* 84.1±11.9*凋亡誘導率（%）0.5±0.5 7.5±1.2* 16.3±1.9* 31.2±2.8*

表3 ZFX siRNA對黃芩素發揮抗腫瘤效應的影響（±s）

表3 ZFX siRNA對黃芩素發揮抗腫瘤效應的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與黃芩素組比較，#P＜0.05；與ZFX siRNA組比較，△P＜0.05；ZFX：細胞鋅指X染色體蛋白

組別對照組黃芩素組ZFX siRNA組ZFX siRNA聯合黃芩素組孔數ZFX siRNA（nmol/L）3 3 3 3 0 0無關siRNA（nmo/L）100 100 100 100 0 0黃芩素濃度（μmol/L）0 40 0 40細胞活力抑制率（%）0 17.8±2.5* 20.6±4.4* 74.3±6.2*#△轉移抑制率（%）0 26.8±5.9* 37.1±6.9* 90.4±15.2*#△凋亡誘導率（%）0.6±0.3 7.1±1.1* 12.3±2.2* 38.2±4.1*#△

圖1 黃芩素對SGC996 ZFX表達水平的影響注：1.對照組；2.40μmol/L黃芩素組；3.80μmol/L黃芩素組；4.160μmol/L黃芩素組；ZFX：細胞鋅指X染色體蛋白

3 討論

黃芩素是目前廣泛使用的天然藥物活性成分，毒副作用較小，它良好的抗腫瘤效應越來越被重視。研究[5]表明黃芩素可顯著下調口腔癌細胞cyclin D1的表達，從而誘導腫瘤細胞周期阻滯，抑制細胞的增殖；黃芩素還可明顯降低DMBA-TPA對小鼠皮膚癌的誘導作用[6]；此外，黃芩素還能在體外顯著抑制卵巢癌細胞的增殖[7]。本研究發現黃芩素具有顯著的體外抗膽囊癌效應，能顯著抑制腫瘤細胞的細胞活力，減弱腫瘤細胞的侵襲轉移能力并誘導膽囊癌細胞發生程序性死亡。

鋅指X染色體蛋白（ZFX）是一種核轉錄因子，基因位于X染色上。ZFX調控細胞的自我更新，在正常情況下維持胚胎和造血干細胞的分裂增殖[8]。研究發現ZFX在多種腫瘤細胞，如肺癌、胃癌、乳腺癌等腫瘤細胞中高表達，促進腫瘤細胞的增殖、轉移并幫助細胞逃避凋亡信號[9-11]。本研究發現黃芩素可顯著下調ZFX的表達水平，推斷黃芩素抗膽囊癌的機制可能和ZFX有關。為了研究ZFX在膽囊癌中的作用，我們用siRNA對ZFX基因進行沉默，結果發現ZFX siRNA有類似黃芩素的抗SGC996作用，而將ZFX siRNA和黃芩素同時作用于SGC996細胞時，腫瘤細胞的活力和轉移能力受到極大的抑制，細胞凋亡程度顯著提高，表明兩者有協同作用。這些結果都支持了黃芩素殺傷SGC996細胞依賴于ZFX的下調這一觀點。綜上所述，本研究結果提示黃芩素有潛在的抗膽囊癌生物效應，其機制可能為下調細胞內鋅指X染色體蛋白的表達水平，為膽囊癌的藥物治療提供了新的途徑和理論依據。

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（收稿：2015-02-04 修回：2015-03-06）

Effect of Baicalein on Cell Activity and the Expression of ZFX Protein in Human Gallbladder Cancer CellLine SGC996

CHEN Hong.Department of Pharmacy,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou(310006),China

Objective To explore the effect of baicalein extracted from Scutellaria Baicalensis Georgi on gallnladder cercinoma and the underlying mechanism.M ethods SGC996 cells were treated with baicalein for 48 h and then were detected for cell viability by MTT assay.Cancer metastasis was evaluated by transwell assay.The apoptosis of SGC996 cells was measured by flow cytometry.The expression of ZFX protein in baicalein-treating SGC996 cells was detected with western blot.Results The cell viability inhibitory rate of SGC996 cells in 40,80, 160,and 320μmol/L baicalein groups were 19.3%±3.8%,37.9%±5.8%,61.6%±7.8%,and 84.2%±10.2%,with a significant difference as compared with control group（0,P＜0.05）.The apoptosis rate of SGC996 cells in control group and 40,80,and 160μmol/L baicalein groups were 0.5%±0.5%,7.5%±1.2%,16.3%±1.9%,and 31.2%±2.8%（P＜0.05）;the inhibitory rate of metastasis in these groups were 0,25.6%±6.6%,57.3%±7.9%,84.1%±11.9%（P＜0.05）.Western blot analysis showed that the expression of ZFX protein in SGC996 cells was significantly suppressed by baicalein.Conclusion Baicalein showed a significant anti-tumor effect on human gallbladder cancer. The mechanism may be due to the down-regulation of ZFX.

human gallbladder cancer cell line;SGC996;baicalein;ZFX;cell viability

杭州市第一人民醫院藥劑科（杭州 310006）