高濃度葡萄糖對牙周膜干細胞成骨分化能力的影響

夏佳佳王 嵐章燕珍

高濃度葡萄糖對牙周膜干細胞成骨分化能力的影響

夏佳佳1王 嵐2章燕珍1

目的 觀察高濃度葡萄糖刺激下牙周膜干細胞（PDLSCs）的增殖能力和成骨分化能力。方法 組織塊法體外培養非糖尿病患者PDLSCs，分別用0mg/L（正常對照組）、1100mg/L（低糖組）、4500mg/L（高糖組）濃度葡萄糖刺激，MTT法檢測PDLSCs增殖能力，礦化誘導后茜素紅染色觀察礦化結節形成,實時定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測Runt相關轉錄因子2（Runx-2）、堿性磷酸酶（ALP）和I型膠原（Col-1）成骨相關基因表達。結果 MTT法檢測顯示高糖組OD值較低糖組和正常對照組低（P＜0.05）；21天成骨誘導后，高糖組礦化結節面積少于低糖組和正常對照組（P＜0.05，P＜0.01）；成骨誘導期間，高糖組ALP、Runx2和Col-1誘導前后相對倍增數低于低糖組和正常對照組（P＜0.05，P＜0.01）。結論 高濃度葡萄糖抑制PDLSCs增殖能力和成骨分化能力。

牙周膜干細胞；高濃度葡萄糖；分化能力；增殖能力

牙周膜由致密的結締組織構成，能夠為牙齦、牙槽骨等牙周支持組織提供組織再生的細胞，牙周組織包括血管上皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞[1]，目前大量研究表明牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）擁有自我更新和多項分化能力，包括分化成神經元細胞、肝細胞、成骨細胞、成軟骨細胞和成脂細胞[2-5]，同時PDLSCs還表達間充質干細胞的表面特異性標記物（STRO-1，CD-44，CD-73，CD-90和CD-105）[6]。

目前針對PDLSCs多項分化的研究中，很多學者在體外均能成功地將PDLSCs向成骨誘導分化[1-2，7]，而葡萄糖能夠影響機體間充質干細胞的復制衰老和線粒體的呼吸[8]，能夠為細胞分子及其代謝中間產物提供足夠的能量[9]。筆者前期研究[10]也得出2型糖尿病患者來源的PDLSCs成骨能力較弱的結論，目前最佳的糖濃度（1100g/L、4500g/L）已經用來研究干細胞的分化功能[11]和牙周膜成纖維細胞多項分化能力[12-14]，高濃度的葡萄糖（4500mg/L）可明顯抑制牙周膜成纖維細胞成骨分化能力及其細胞活性。本實驗研究在不同葡萄糖濃度刺激下，牙周膜干細胞成骨分化能力的表達。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 α-MEM培養基、鼠抗人STRO-1單克隆抗體（R&D SYSTEMS公司，美國）、膠原酶、鼠抗人CD146單克隆抗體（Abcam公司，美國）、一步法RT-PCR試劑盒（Takara，日本）、MTT（Sigma，美國）、胎牛血清（四季青，杭州）、胰蛋白酶(Gibco，美國)、細胞總RNA提取試劑盒、倒置顯微鏡以及照相系統（OLYMPUS，日本）、real time PCR儀器（Applied biosystems，美國）。

1.2 細胞分離與培養 牙周組織來源于臨床上因正畸治療需要拔除的13～23歲非糖尿病患者，共8名，年齡（17.5±3.9）歲，均來自浙江大學醫學院附屬第二醫院口腔外科門診部，常規進行原代細胞培養[10]。

1.3 有限稀釋法克隆化培養純化PDLSCs[10]取對數生長期的第1代細胞，調整細胞密度至100～150個/mL，接種于直徑10cm的一次性培養皿中，3mL/皿，培養貼壁后標記單個細胞并補液至8mL，常規培養7～10天，出現細胞克隆。

1.4 PDLSCs的初步鑒定[10]

1.4.1 克隆形成率 克隆形成數量/接種細胞數量× 100%

1.4.2 免疫熒光細胞檢測波形絲蛋白、角蛋白、細胞表型分子CD146和STRO-1 分別取第二代克隆形成細胞5×103/孔接種于24孔板，4%多聚甲醛固定30min，加羊血清封閉30min，直接加鼠抗人CD146單克隆抗體（1：100稀釋）37℃孵箱孵育2h，加山羊抗小鼠IgG（1：100稀釋），37℃孵箱孵育40min，Hochest胞核襯染，洗盡后避光觀察、拍照。STRO-1、波形絲蛋白、角蛋白染色方法同CD146。

1.5 實驗分組 正常對照組：常規α-MEM培養液（含10%胎牛血清）組。低糖組：常規α-MEM培養液（含10%胎牛血清）中含1100mg/L葡萄糖組。高糖組：常規α-MEM培養液（含10%胎牛血清）中含4500mg/L葡萄糖組[14]。

1.6 MTT法檢測不同濃度下細胞增殖能力[10]取第二代PDLSCs制成細胞懸液，1×104/孔接種于三個96孔板，常規培養2～3天后，每孔加MTT（5mg/mL）50μL，置37℃孵箱孵育4h，加150μL DMSO，避光震蕩15min，每組細胞設置6個副孔，三個空白對照孔，選擇490nm波長的酶標儀檢測OD值。連續檢測9天，繪制細胞生長曲線。

1.7 成骨誘導及茜素紅染色[10]取第二代PDLSCs制成細胞懸液，2×104個細胞分別接種于三個6孔板中。常規培養，待細胞增殖到孔底的70%時，換為不同濃度葡萄糖培養液和成骨誘導液（10%胎牛血清的α-MEM培養液中含10mmol/mLβ-甘油酸鈉、50μg/mL維生素C、1×10-8mol/L地塞米松、100μg/mL鏈霉素、100U/mL青霉素），連續培養21天后棄原誘導液，4%多聚甲醛固定，0.1%茜素紅37℃孵箱染色，倒置顯微鏡下觀察礦化結節。

1.8 RT-PCR檢測Runx-2、Col-1和ALPmRNA表達[10]分別收集不同濃度葡萄糖刺激下成骨誘導7天后的三組PDLSCs，用細胞總RNA提取試劑盒提取培養細胞總RNA，β-actin為內參照。參照Gen-Bank數據庫，采用Primer primer5.0計算機軟件設計引物，設計基因序列見表1。由Takara公司合成，反應條件參考產品說明書。

表1 基因序列表

1.9 統計學方法 應用SPSS15.0軟件進行統計分析，檢測結果以均數±標準差（±s） 表示，單因素方差分析比較三組MTT值、礦化結節面積和相關mRNA表達的差異，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PDLSCs的分離及純化 本實驗用組織塊法培養PDLSCs，7～12天組織塊周圍有細胞爬出，之后1～2周左右達到80%匯集，篩選出的克隆細胞大多呈長梭形，少數為橢圓形，胞體較小，胞漿豐滿。

2.2 PDLSCs的初步鑒定

2.2.1 克隆形成率 有限稀釋法克隆后的細胞克隆形成率為（25.63±2.53）%（圖1，封二）。

2.2.2 波形絲蛋白、角蛋白、CD146和STRO-1的表達 免疫熒光細胞檢測發現，有限稀釋法克隆后細胞角蛋白陰性表達（圖2A，封二），波形絲蛋白陽性表達（圖2B，封二），說明PDLSCs來源于中胚層；同時，檢測間充質干細胞表型標記分子STRO-1、CD146，均呈陽性表達（圖2C、D，封二）。

2.3 細胞增殖能力 連續9天吸光光度值（OD值）檢測，發現兩組不同濃度血糖刺激后PDLSCs呈現出不同的細胞增殖能力和活性，三組細胞中，細胞的增殖曲線為“S”型，經統計學分析，第一天OD值組間比較無明顯差異。而在2～9天中，高糖組細胞增殖能力與活性受到明顯的抑制，正常對照組增殖能力最強，組間差異有統計學意義（P＜0.05）（圖3，封二）。

2.4 鈣化結節形成 三組細胞成骨礦化液誘導后倒置顯微鏡下觀察可見米粒大小灰白色的小結節，誘導第21天時，茜素紅染色后鏡下可見染成紅色鈣化結節，相同視野下，與正常對照組、低糖組比較，高糖組誘導后鈣化結節面積形成最少，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）（圖4，封二）。

2.5 RT-PCR結果 三組PDLSCs經成骨誘導液誘導后，分別對早期成骨基因Runx-2、ALP和Col-1進行檢測，結果顯示三組均有較為明顯的成骨分化的表現，高糖組的成骨相關基因誘導后的倍增數較低糖組、正常對照組低（P＜0.05，P＜0.01）（圖5，封二）。

3 討 論

機體的成纖維細胞作為一種組織細胞，具有維持組織結構、合成細胞外基質和參與細胞間信號傳導等功能，PDLSCs作為牙周結締組織中的重要細胞，能夠合成不同的細胞外基質蛋白和膠原纖維，同時，PDLSCs還能夠分化為成骨樣細胞和成牙本質樣細胞，參與組織的修復與再生[8-9]，因此，PDLSCs的活性對牙周組織再生起著非常重要的作用。

糖尿病作為一種系統性疾病對機體其他的組織和器官具有很大的影響，高血糖能夠抑制組織器官細胞增殖分化功能，包括腎小管上皮細胞、胚胎系膜細胞和臍靜脈內皮細胞[13-14]，同時可明顯抑制成骨細胞的礦化能力[15]。

近年研究[16-17]發現，2型糖尿病是牙周炎發生發展的促進因素，加速牙周組織的破壞。牙周膜成纖維細胞（PDLCs）的增殖能力近年來也得到更多學者的重視，Nishimura等[12]研究發現不同葡萄糖濃度對細胞的增殖具有一定的影響，當血糖＞18mmol/L時的高糖狀態下PDLCs增殖能力呈現降低的現象，發現高糖狀態培養下的PDLCs過度表達纖維蛋白受體，從而抑制了這些細胞向血小板來源的生長因子的趨化反應。Ohgi等[18]研究學者研究高血糖對牙齦成纖維細和PDLCs增殖能力的影響機制，發現高血糖對牙齦成纖維細胞的增殖能力并無明顯的影響，而對PDLCs出現了明顯的抑制作用；Kim等[19]通過高糖刺激得出高糖狀態可以明顯抑制PDLCs的細胞活性與成骨項分化，高糖刺激下可積累大量VLA-5促使細胞外基質和整合素的分泌，增強了PDLCs的自身吸附能力，從而導致PDLCs在牙周組織損傷中細胞活性能力（遷徙能力）的減弱，延長修復周期[12]。同時高糖狀態可能通過激活caspase-3的信號轉導通路，促進PDLCs的凋亡[20]。本實驗中多次檢測高糖刺激后PDLSCs的增殖情況，結果顯示在高糖狀態下PDLSCs的增殖能力和細胞活性受到明顯的抑制，該結果表達趨勢與前期研究學者研究PDLCs相似。而臨床上血糖未控制的糖尿病患者血清中血糖含量均較高（大多高于4500mg/L），因此可以認為糖尿病患者牙周損傷嚴重的可能原因是高血糖狀態下抑制了牙周組織中PDLSCs的細胞活性，減少了PDLSCs向PDLCs分化，最終影響組織修復。

很多學者研究長期的高血糖狀態對骨組織的影響，發現血糖未控制的糖尿病患者，骨組織的改建和代謝能力降低[21]，說明高血糖能夠影響機體骨密度和骨代謝，容易引起骨質疏松等并發癥，本實驗的另外一個主要目的是觀察高糖刺激下PDLSCs在骨形成過程中鈣化結節面積及早期相關基因的表達，研究高糖對PDLSCs成骨能的影響。

與牙齦成纖維細胞比較，PDLCs具有更高的ALP活性、更高細胞表型分子骨涎蛋白表達和更多的細胞外基質分泌[22]。研究者利用成骨礦化液對PDLCs進行誘導，PDLCs能夠向成骨樣組織分化[19]。基于前期研究的誘導條件，本實驗研究結果顯示對照組和低糖組在誘導14天左右出現了早期顆粒樣大小的礦化結節，隨著天數的增加，礦化結節面積增加，第21天時，對照組和低糖組的礦化面積可以用肉眼辨認，而高糖組則不明顯，實驗結果與其他研究學者結果相一致。

Runx-2、ALP和Col-1都是成骨的早期基因，ALP是骨形成標志[23]，Runx-2表達是成骨細胞分化的開始，也是骨形成過程中最早和最具特異性的標志[24]，是ALP、Col-1等早期成骨基因的上游基因，正是因為Runx-2的作用刺激了ALP、Col-1等早期成骨細胞相關基因，促進成骨分化。從本實驗的結果我們提出這樣的假設：因高糖組PDLSCs細胞成骨分化過程中Runx-2基因倍增數明顯較對照組和低糖組低，上游基因表達能力下降，從而影響下游的ALP、Col-1的表達，進而影響了PDLSCs成骨向分化的能力。該結果與 Sawangmake等[25]研究高糖狀態對PDLSCs向神經元細胞分化趨勢相似，但具體調控機制目前未見報道。因此，對于糖尿病患者，無論是1型糖尿病還是2型糖尿病，良好的血糖控制，能夠使牙周組織更加健康，延長牙齒在牙槽骨上的使用時間[26]。

總之，本實驗結果一方面說明了PDLSCs具有向成骨樣細胞分化的潛能，另外方面則體現了不同葡萄糖濃度對PDLSCs功能的影響，在高葡萄糖濃度的誘導作用下，PDLSCs對誘導條件的刺激分化能力出現“反應性降低”，導致PDLSCs向成骨分化能力減弱，從而解釋糖尿病狀態可能是通過影響PDLSCs成骨能力，加速糖尿病患者牙周炎發生發展，抑制骨形成，加重病變程度。但由于本實驗研究限于體外，未體現PDLSCs在體內的生物學特性，因此高濃度葡萄糖對PDLSCs影響的具體作用機制還需要進一步的研究。

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（收稿：2015-03-02 修回：2015-03-30）

Effects of High Glucose on Proliferation and Osteogenic Differentiation of Periodontal Ligament Stem Cellsin Vitro

XIA Jiajia1,WANG Lan2,ZHANG Yanzhen1. 1 Department of Cosmetic Dentistry,Second Affiliated Hospital,Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou(310000),China;2 Department of Conservative Dentistry and Endodontics,the Affiliated Hospital of Stomatology,Chongqing Medical University;Chongqing Research Center for Oral Disease and Biomedical Sciences,Chongqing(401147),China

Objective To investigate the effect of high glucose concentration on the cellular activity and osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells（PDLSCs）in vitro.M ethods PDLSCs from non-diabetic patients were obtained and cultured with tissue block method in a low glucose-concentration medium（1100mg/L of glucose）or in a high glucose-concentration medium（4500mg/L of glucose）,respectively,for 14d.Zero mg/L of glucose group served as blank control.MTT assay was used to evaluate cellular viability.The osteogenic differentiation capacity of PDLSCs was determined by alizarin red staining after mineralization induction and real time PCR for detection of Runx-2,alkaline phosphatase（ALP）,and collagen I genes.Results MTT assay results showed that the OD value in high glucose group was lower than that in low glucose group（P＜0.05，P＜0.01）.After 21-day culturing,the calcified area was reduced and the expression of Runx-2,ALP,and collagen I genes to the toal culture dish of PDLSCs in high glucose group were lower than those in low glucose group（P＜0.05，P＜0.01）.Conclusion High glucose inhibits the proliferation and differentiation of PDLSCs.

periodontal ligament stem cells;high glucose;differentiation;proliferatio

1浙江大學醫學院附屬第二醫院綜合牙科（杭州 310052）；2重慶醫科大學附屬口腔醫院牙體牙髓科，重慶市口腔疾病與生物醫學重點實驗室（重慶 401147）

夏佳佳，Tel：18857862012