骶3神經電調節對脊髓損傷早期大鼠逼尿肌細胞凋亡及膀胱纖維化影響的實驗研究

宋 晨諸靖宇吳金星徐智慧張大宏

骶3神經電調節對脊髓損傷早期大鼠逼尿肌細胞凋亡及膀胱纖維化影響的實驗研究

宋 晨1諸靖宇1吳金星1徐智慧2張大宏2

目的 觀察骶3神經電調節對脊髓損傷早期大鼠逼尿肌細胞凋亡及膀胱纖維化影響。方法 取雌性成年SD大鼠90只，隨機分成實驗組60只，空白對照組30只，采用脊髓橫斷法建立大鼠神經源性膀胱的模型。實驗組大鼠隨機分為電針組及陰性對照組，各30只。電針組進行電極植入，并行電調節治療2周。3組大鼠2周后同時處死取材，均分別采用膠原染色、苦杏酸天狼星紅染色、免疫組化方法來觀察逼尿肌纖維化程度。采用透射電鏡觀察逼尿肌細胞超微結構改變。結果①膠原染色及苦杏酸天狼星紅染色觀察，電針組同陰性對照組相比，平滑肌細胞之間膠原纖維的數量明顯減少，細胞排列規則。②電針組膀胱組織CollagenⅠ和CollagenⅢ表達分別為（1.042± 0.213）、（1.532±0.141），均明顯低于陰性對照組的（2.049±0.246）、（3.901±0.208），電針組Ⅰ/Ⅲ型膠原比例較陰性對照組明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。陰性對照組CollagenⅠ和CollagenⅢ表達顯著高于空白對照組的（1.154±0.124）、（0.780±0.127），陰性對照組Ⅰ/Ⅲ型膠原比例較空白對照組明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。③電鏡觀察，電針組與陰性對照組相比，逼尿肌細胞表面平滑，排列均勻，胞漿內線粒體結構完整，無腫脹破裂現象，細胞結構接近于空白對照組。結論骶3神經電調節能抑制脊髓損傷早期大鼠膀胱逼尿肌間質中膠原纖維的表達，減少脊髓損傷后大鼠逼尿肌細胞的凋亡，促進膀胱功能恢復。

大鼠；脊髓損傷；骶3神經電調節；逼尿肌細胞凋亡；膀胱纖維化

圖1 各組大鼠膀胱逼尿肌纖維化程度比較（膠原VG染色 ×400）注：a、b、c分別為空白對照組、陰性對照組、電針組大鼠膀胱逼尿肌細胞通過VG染色觀察到的纖維化程度

圖2 各組大鼠膀胱逼尿肌纖維化程度的比較（苦杏酸天狼星紅染色，×400）注：a、b、c分別為空白對照組、陰性對照組、電針組大鼠膀胱逼尿肌細胞通過苦杏酸天狼星紅染色觀察到的纖維化程度

圖3 各組大鼠膀胱組織中CollagenⅠ和CollagenⅢ的表達（免疫組化染色，×400）注：a、b、c分別為空白對照組、陰性對照組、電針組大鼠膀胱組織中CollagenⅠ的表達情況（陽性表達呈棕黃色，陰性對照組高表達）；d、e、f分別為空白對照組、陰性對照組、電針組大鼠膀胱組織中CollagenⅢ的表達情況（陽性表達呈棕黃色，陰性對照組高表達）

圖4 各組大鼠膀胱逼尿肌電鏡下超微結構表現（×24 000）注：a為空白對照組，b為陰性對照組，c為電針組

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是導致患者出現嚴重排尿障礙、上尿路損害以致腎功能衰竭的病因之一[1]。脊髓損傷后神經源性膀胱早期階段因缺乏神經刺激導致逼尿肌凋亡，逼尿肌中膠原纖維的增加導致膀胱順應性下降[2]，繼而出現膀胱纖維化、儲尿及排尿功能障礙。動物實驗發現，電針關元穴可以緩解脊髓損傷后膀胱逼尿肌細胞凋亡[3]。本實驗通過完全脊髓損傷大鼠模型，觀察電調節骶3神經對大鼠膀胱逼尿肌超微結構的改變及逼尿肌纖維化程度的影響，以期探討脊髓損傷后神經源膀胱早期骶神經電調節療效的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 健康成年雌性SD大鼠90只購自上海斯萊克，合格證號：SCXK（滬）：2012-002。根據完全隨機實驗設計，將90只大鼠隨機編號，取數，排序，分成實驗組60只，空白對照組30只，采用脊髓橫斷法建立大鼠神經源性膀胱的模型。實驗組大鼠中隨機分為電針組及陰性對照組。即進入正式試驗的大鼠樣本為每組30只。

1.2 動物模型制作[4]腹腔注射戊巴比妥鈉（25～30mg/kg）麻醉大鼠，需要手術的兩組大鼠經背部縱行切口，然后在脊髓T9節段行全橫斷術，并切除其上4mm脊髓組織，清除損傷腔內殘留的神經組織，在缺損腔內植入骨臘作為填充物。逐層縫合切口。造模成功標準：切除脊髓時尾巴痙攣性擺動，雙后肢拖地爬行。大鼠脊髓損傷后立即處于脊髓休克期，部分在恥骨聯合上緣可觸及脹大的膀胱。初期采用腹部按壓方式輔助排尿。

1.3 新型針式電極植入[5]及骶3神經電調節方法 縫合皮膚即刻，電針組大鼠開始植入針式電極。平第3骶椎棘突，用帶電刺激穿刺針以75度角向內斜刺20mm。術后前5天每天對造模成功大鼠按壓下腹部膀胱區輔助排尿3次，每只大鼠均單籠飼養。術后腹腔注射青霉素（每天50 000U/kg，連續3天）。將電針組大鼠用裝置固定，背部外露，將電極線連接穴位電針儀，予連接肌電刺激儀，用頻率3～5Hz的連續波，強度3～5V電刺激，以大鼠骶部和/或尾部顫動而不致全身顫動的表現為宜；每次電調節30min，每天1次，共2周。

1.4 取材時間及方法 待電針組電針治療2周后，同時處死3組大鼠，3組大鼠膀胱組織均分別應用膠原（VG）染色、苦杏酸天狼星紅染色、免疫組化方法，觀察逼尿肌纖維化程度（膠原纖維含量、Ⅰ/Ⅲ型膠原比例）；用透射電鏡觀察逼尿肌細胞超微結構。

1.5 檢測方法

1.5.1 膠原（VG）染色及苦杏酸天狼星紅染色觀察逼尿肌纖維化程度 厚度為4μm的切片予二甲苯脫蠟15min，梯度酒精復水，分別用VG染液及0.1%飽和苦味酸-天狼星紅溶液染色。

1.5.2 免疫組化法檢測大鼠膀胱組織CollagenⅠ和CollagenⅢ的表達 陽性反應：細胞漿呈棕黃色為陽性表達。染色結果采用半定量分析方法：評分以染色強度結合陽性細胞數百分比進行乘積。染色強度以多數細胞呈現的染色強度并減去背景著色計分：無明顯著色為0分，淡黃色或輕微黃色為1分，深黃或棕黃色為2分，棕褐色或黑褐色為3分。陽性細胞百分比即每張免疫組化切片選擇5個不同的視野（× 400）觀察，每個視野計數100個細胞中陽性細胞數，計算陽性細胞平均數：≤5%評0分，6%～25%評1分，26%～50%評2分，51%～75%評3分，＞75%評4分。

1.5.3 透射電鏡觀察超微結構 取大鼠膀胱肌肉組織，標本修剪成約1mm×1mm×1mm大小的膀胱逼尿肌組織塊，置于2.5%戊二醛溶液低溫固定，包埋、切片、鋨酸染色定位后超微切片（120nm），透射電鏡（× 24 000）觀察逼尿肌組織超微結構改變。

1.6 統計學方法 建立Excel數據庫，應用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析。計量數據以（±s） 表示，均為正態資料。組間整體分析為單因素方差分析，兩兩比較為LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 大鼠造模后，共死亡5只，即有55只造模成功，確保了陰性對照組和電針組樣本量均大于25只。造模成功大鼠均存活良好，有明顯的后肢運動功能障礙，證實為成功的脊髓損傷模型。

2.2 各組大鼠膀胱逼尿肌纖維化程度比較

2.2.1 膠原VG染色觀察比較 空白對照組平滑肌細胞之間有膠原纖維和肌纖維存在，見圖1a（插頁）。陰性對照組平滑肌細胞之間膠原纖維較空白對照組大量增多，肌纖維明顯減少，見圖1b（插頁）。電針組平滑肌細胞之間的膠原纖維較陰性對照組明顯減少，細胞排列較規則，見圖1c（插頁）。

2.2.2 苦杏酸天狼星紅染色觀察比較 空白對照組平滑肌細胞之間Ⅰ型膠原近似平行排列，密度均一；Ⅲ型膠原分布于Ⅰ型膠原周圍，見圖2a（插頁）。陰性對照組平滑肌細胞之間Ⅰ型膠原縱橫交錯，排列紊亂，密度分布不均；Ⅲ型膠原比例較空白對照組增加，Ⅲ型膠原呈疏網狀散布于Ⅰ型膠原周圍，見圖2b（插頁）。電針組平滑肌細胞之間Ⅰ/Ⅲ型膠原比例較陰性對照組明顯減少，細胞排列規則，見圖2c（插頁）。

2.3 各組大鼠膀胱組織CollagenⅠ和CollagenⅢ表達 顯微鏡下觀察，CollagenⅠ和CollagenⅢ陽性表達呈棕黃色，每張免疫組化切片選擇5個不同的視野（×400）觀察，并判讀陽性表達強度和陽性率。對每個視野均進行染色強度計分與陽性細胞百分比乘積評分，評分以陽性細胞百分比與染色強度的乘積：0分為陰性（-），1～6分為弱陽性，7～12分為強陽性。評分結果見表1。

對表1資料進行整體分析（單因素分析），兩個指標的3個組間整體比較均有統計學意義（P＜0.05）。陰性對照組CollagenⅠ和CollagenⅢ表達顯著高于空白對照組（P均＜0.05），陰性對照組Ⅰ/Ⅲ型膠原比例較空白對照組和電針組明顯增高，差異有統計學意義（P均＜0.05）。電針組CollagenⅠ和CollagenⅢ的表達及Ⅰ/Ⅲ型膠原比例與空白對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1和圖3（插頁）。

表1 各組大鼠膀胱組織CollagenⅠ和CollagenⅢ表達（±s）

表1 各組大鼠膀胱組織CollagenⅠ和CollagenⅢ表達（±s）

注：與陰性對照組比較，▲P＜0.05；與空白對照組比較，△P＜0.05

組別陰性對照組空白對照組電針組只數26 30 29 F P CollagenⅠ表達2.049±0.246△1.154±0.124 1.042±0.213▲113.347＜0.05 CollagenⅢ表達3.901±0.208△0.780±0.127 1.532±0.141▲1,531.591＜0.05

2.4 各組大鼠膀胱逼尿肌超微結構比較 電鏡觀察，空白對照組大鼠膀胱逼尿肌肌細胞分布均勻，走行整齊，細胞胞核形狀規則，胞漿內少量線粒體出現輕微水腫現象，見圖4a（插頁）。陰性對照組較空白對照組逼尿肌細胞間間距變寬，外形、大小不一致，分布不均勻，排列走行紊亂，有大量凹陷，胞漿內線粒體腫脹破裂呈空泡狀，見圖4b（插頁）。電針組較陰性對照組逼尿肌細胞表面平滑，排列均勻，胞漿內有少量線粒體，且結構較完整，部分腫脹破裂現象，細胞結構接近于空白對照組，見圖4c（插頁）。

3 討論

神經源性膀胱的一個顯著病理特征是逼尿肌纖維化，即肌束間大量膠原纖維沉積，是導致膀胱順應性下降，逼尿肌攣縮或收縮無力的主要原因[6]，因而出現膀胱貯存和排空障礙。逼尿肌萎縮與纖維化易導致膀胱高壓儲尿，進而引起上尿路損害，導致腎功能衰竭等嚴重并發癥，因此危害尤甚[7]。膠原纖維是細胞外基質的主要成分，膀胱壁的膠原纖維主要為Ⅰ型和Ⅲ型，Ⅲ型膠原是膀胱順應性的決定因素，其含量增加將會導致膀胱壁彈性的喪失[8]和平滑肌功能的減退，從而導致膀胱攣縮、膀胱高壓。Deveaud等[9]研究發現，在低順應性膀胱組織中總的膠原含量僅增加10%，而Ⅲ型膠原的含量卻增加49%。本次實驗也發現，陰性對照組大鼠膀胱逼尿肌中Ⅰ型、Ⅲ型膠原纖維含量均明顯增加，但Ⅲ型膠原纖維含量增高更為顯著（P＜0.05）。

脊髓損傷后功能恢復是臨床治療領域的難題之一；神經系統損傷后難以恢復，并且影響神經所支配的效應器官，如膀胱逼尿肌、膀胱感覺等[10]。神經電刺激和調節是神經源性膀胱治療的新亮點，國內有學者通過骶3神經電針脊髓損傷患者來改善排尿、預防尿路感染等并發癥，取得明顯療效[11]。孫嵐等[12]動物實驗發現，電針調節對逼尿肌反射亢進有平衡作用，可抑制逼尿肌的過度收縮，改善膀胱順應性，并能改善膀胱組織的病理變化。電針調節既具有改善膀胱、尿道括約肌等骶神經支配的效應器官功能，也能促進骶髓排尿中樞恢復[13]。

目前脊髓損傷后神經源性膀胱的后期治療尚未取得突破性進展，有必要探索在脊髓損傷的早期階段進行積極治療的可能性。前期動物實驗已經發現，電針調節明顯促進脊髓損傷早期膀胱尿道功能恢復，抑制逼尿肌過度收縮，緩解尿道括約肌痙攣，能改善膀胱容量[5]。本實驗采用骶3神經通路對脊髓損傷早期膀胱進行弱電刺激，結果提示電針組大鼠膀胱Ⅲ型膠原纖維含量顯著低于陰性對照組；透射電鏡發現電針組逼尿肌細胞胞漿內線粒體破裂程度輕微，超微結構的病理狀態得到改善。

綜上所述，骶3神經電調節可以減少脊髓損傷早期膀胱逼尿肌細胞凋亡，抑制逼尿肌纖維化進程，促進脊髓損傷后膀胱逼尿肌功能恢復，改善膀胱順應性。對于神經電調節是否促進骶髓排尿中樞恢復，有待于進一步實驗研究證實。電調節骶3神經對脊髓損傷后神經源性膀胱早期康復的機制研究具有積極意義。

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（收稿：2014-08-20 修回：2014-12-23）

Effect of Sacral Neuromodulation Via S3 Foramen on the Apotosis of Detrusor Cells and Fibrosis of theBladder in Spinal Injured Rats

SONG Chen1,ZHU Jingyu1,WU Jinxing1,XU Zhihui2,ZHANG Dahong2.1Department of Urology,the Third People's Hospital of Hangzhou,Hangzhou (310009),China;2Department of Urology, Zhejiang Provincial People's Hospital,Hangzhou(310014),China

Objective To investigate sacral nerve stimulation through S3 foramen for the treatment of detrusor cell apoptosis and neurogenic fibrosis of the bladder in rats with spinal cord injury（SCI）.M ethods Ninety SD female rats were randomly divided into experimental group（n＝30）,control group（n＝30）,blank group（n＝30）.SCI model was established by crosscutting spine.Rats in experimental group were implanted with electrical acupuncture poles and had neruomodulation for 2 weeks.Rats in 3 groups were all sacrificed at the end of nerve stimulation and immunohistochemistry,collagen staining and Sirius Red F3B（SR）staining and transmission electron microscope（TEM）were used to observe the apoptosis and fibrosis of the detrusor muscle.Results Collagen and SR staining showed that less collagen fiber was seen between detrusor cells and the cells were more regular and smooth in experimental group than those in control group.Collagen I and collagen III were decreased in experimental group than those in control group（collagen I:1.042±0.213 vs 2.049±0.246,collagen III:1.532±0.141 vs 3.901±0.208,P＜0.05）.The ratio of collagen I to collagen III in experimental group was lower than that in control group with significant difference（P＜0.05）.The collagen I and collagen III of control group was higher than that of blank group（collagen I:1.154±0.124,collagen III:0.780±0.127,P＜0.05）and the ratio of collagen I to collagen III was also higher（P＜0.05）.TEM observed that the cells of experimental group were more regular and smoother than those ofcontrol group and no cell edema and destroied and the construction of the cells were similar to the normal cells（blank group）.Conclusion The S3 nerve electrical stimulation may improve bladder function by inhibiting apoptosis and fibrosis of detrusor cells in SCI rats.

rats;spinal cord injury;S3 neuromodulation;detrusor cell apoptosis;bladder fibrosis

杭州市科技計劃項目（No.20110833B15）；浙江省醫藥衛生科技計劃項目（No.2011KYB070）

1杭州市第三人民醫院泌尿外科（杭州 310009）；2浙江省人民醫院泌尿外科（杭州 310014）

徐智慧，Tel：13757179772；E-mail：jhtotal@163.com