肝癌組織RPA1的表達變化及意義

張光林，王旭東，占紅，蔣慧，陳曦

(黃石市中心醫院，湖北黃石435000)

原發性肝癌是全球最常見的惡性腫瘤，為全球第5位常見腫瘤，占癌癥死亡第2位［1］。目前發現肝癌為多蛋白、多基因參與、多步驟形成的疾病，但是其發病的具體分子機制仍不清楚。復制蛋白A(RPA)是真核細胞單鏈DNA(ssDNA)結合蛋白，在DNA代謝中RPA發揮重要作用，包括DNA復制、重組，以及 DNA損傷修復。RPA共由3個亞單位(RPA1、RPA2、RPA3)組成，每個亞單位都含有至少1個DNA結合結構域(DBD)。RPA1含有4個DBD結構域，分別稱為 DBDA、DBDB、DBDC、DBDF。其中DBDA、DBDB的DNA結合活性最強［2］。研究證實，RPA在腫瘤組織中高表達，并且參與腫瘤的發生發展［3］。目前國內外尚未見有關原發性肝癌與RPA相關研究的臨床報道。本文進行了相關探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇本院肝膽外科及腫瘤外科2013年8月～2014年2月進行手術治療的肝癌患者30例，男22例、女8例，年齡42～62歲、中位年齡51歲。術中在無菌條件下留取癌組織以及距離癌邊緣≥3 cm癌旁組織。用生理鹽水沖洗后置入準備好的去RNA酶凍存管中，迅速將凍存管放入含冰塊的保溫桶內保存。標本于30 min內送入-80℃冰箱中凍存備用。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR法檢測RPA1 mRNA 利用總RNA提取試劑盒(北京TIANGEN公司提供)完成總RNA提取，并用紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度。應用軟件Primer5.0設計引物，由上海生物化學公司合成cDNA，引物序列如下:RPA1:上游5＇-AAGTGGAGACCTACAACGAC-3＇;下游 5＇-ACAACCACCTGAGCGTAT-3＇;擴增產物為 312 bp。β-actin:上游5＇-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3＇;下游 5＇-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3＇;擴增產物為 285 bp。以cDNA為模板，RPA1、β-actin兩種引物分別進行PCR反應;經凝膠成像儀成像，用Image J圖像分析軟件進行半定量分析。

1.2.2 Western blotting法檢測RPA1蛋白 取100 mg組織，提取蛋白，按照BCA試劑盒(碧云天生物技術研究所提供)說明測定蛋白的含量，采用SDS-PAGE電泳，進行轉膜，封閉，一抗孵育;最后進行顯色，取出條帶晾干，照相。將膠片進行掃描或拍照，測定目的條帶的灰度值。

1.2.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。數據以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，兩組以上比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RPA1 mRNA及蛋白在肝癌組織及其癌旁組織中的表達比較 見表1、圖1、圖2。

2.2 RPA1表達與肝癌臨床病理參數的關系 見表2 和圖3、4。

3 討論

RPA在DNA延長和復制開始階段起著重要作用［4］。近年研究發現，RPA不僅參與DNA復制，而且參與DNA的損傷修復。當細胞周期進程中出現異常事件，如DNA損傷或復制受阻時，細胞會很快啟動DNA損傷修復調控體系，及時中斷細胞周期的運行，以提供足夠的時間修復損傷，保證細胞遺傳的穩定性［5，6］。RPA 主要參與堿基切除修復、核苷酸切除修復、雙鏈斷裂修復和DNA錯配修復。在核苷酸切除修復中，RPA 參與 DNA 損傷識別［7，8］，招募通用轉錄因子到達損傷部位。通用轉錄因子的兩個亞基XPB和XPD打開損傷的DNA，XPA結合至損傷鏈，RPA結合至未損傷鏈以穩定該開放狀態，然后由DNA切除修復交叉互補基因和DNA修復基因F形成的異二聚體切除損傷DNA的5＇端，DNA修復基因XPG切除3＇端，去除包含損傷部位的寡核苷酸片段，隨后DNA聚合酶填充于該間隙，合成新的DNA，最后DNA連接酶補平缺口［9］。DNA雙鏈斷裂為最嚴重的損傷形式，RPA與雙鏈斷裂修復基因(Rad52、Rad51、Rad54)相互作用完成 DNA 修復，在此過程中，首先是 MRN復合物(Mre11/Rad50/Nbs1)切割雙鏈斷裂的DNA末端產生3＇末端。之后，Rad51與 RPA、Rad54、Rad52等結合在 DNA單鏈的3＇突出末端，促進鏈交換在同源DNA間進行，連接DNA鏈的斷裂并修復可能的缺失。

表1 RPA1 mRNA及蛋白在肝癌組織及其癌旁組織中的表達(±s)

表1 RPA1 mRNA及蛋白在肝癌組織及其癌旁組織中的表達(±s)

注:與癌旁組織比較，*P＜0.05

組織 n RPA1 mRNA RPA1蛋白肝癌組織 30 0.635±0.228* 0.876±0.205*癌旁組織30 0.448±0.186 0.727±0.153

圖1 RPA1 mRNA在肝癌組織及癌旁組織中的表達

圖2 RPA1蛋白在肝癌組織及癌旁組織中的表達

表2 RPA1表達與肝癌臨床病理參數的關系

圖3 RPA1 mRNA在肝癌組織不同分期中的表達

圖4 RPA1蛋白在肝癌組織不同分期中的表達

肝癌發展過程中腫瘤細胞的異常生長需要DNA的大量復制及充足的修復能力。我們假設認為，在肝癌DNA損傷修復過程中，由于RPA參與DNA的損傷修復，導致其表達上調，且隨著肝癌的進展RPA的表達逐漸增多。本研究結果顯示，RPA1在30例肝癌組織中的表達與癌旁組織相比上調，與國內外有關實驗結果均一致，提示RPA1有可能參與了肝癌的形成。本研究結果還顯示，RPA1的表達上調與肝癌患者性別、年齡、乙肝感染、病理分級、淋巴結轉移、門脈癌栓等無關，與肝癌患者的TNM分期呈正相關，進一步證明了RPA可能參與了腫瘤的發生發展過程。但與國內外有關研究有一定的差異，Levidou等［10］報道RPA1和RPA2在膀胱癌中高表達，但是隨著腫瘤的臨床分期升高其表達反而下降，其中RPA2對腫瘤的早期發展意義明顯，他們推斷RPA2可能與細胞周期蛋白D1協同推動早期膀胱癌的形成。原發性肝癌的發生是以多個抑癌基因失活和原癌基因激活為基礎的多階段多步驟過程。抑癌基因p53的突變失活將促進肝癌的發生，是肝細胞生物學特性發生改變的重要分子事件。近年相關研究證實，RPA(特別是RPA2)與p53基因相互作用，從而抑制野生型p53的活性，使受損的DNA在細胞周期檢查點得到修復［11］。Givalos等［12］運用免疫組化法檢測了RPA1、RPA2在130例結腸癌中的表達，結果顯示RPA1、RPA2與患者的臨床分期、淋巴結轉移有關，在Ⅱ、Ⅲ期結腸癌組織中RPA1、RPA2表達越高的患者，生存時間越短;且RPA2的表達與腫瘤組織分級相關，他們推測正是RPA的過度表達抑制了p53抑癌基因的活性，從而使腫瘤更容易形成。Dahai等［13］檢測 RPA1和RPA2在食管癌組織中的表達情況，結果顯示RPA1和RPA2在食管癌組織中的表達隨著臨床分期、組織分級的升高而升高，且RPA1表達越高的患者生存率越低。因此他們得出結論RPA可以作為預測食管癌惡性程度及臨床進展的重要指標。

綜上所述，RPA表達的增多可能與腫瘤的生長有密切關系。但是RPA在不同腫瘤中的不同階段作用可能存在差異，在不同腫瘤中RPA可能與不同的DNA修復基因相互作用，從而對腫瘤的發生發展起到作用。在本實驗中由于條件所限只研究了RPA1在肝癌中的半定量表達，RPA1與RPA2在肝癌形成中發揮著怎樣的不同作用，有什么共同聯系，需要進一步實驗研究。由上述基礎及臨床試驗可知RPA在DNA復制及修復中有重要作用，有望成為腫瘤治療的重要靶點

［1］Bosch FX，Ribes J，Cleries R，et al.Epidemiology of hepatocellular carcinoma［J］.Clin Liver Dis，2005，9(2):191-211.

［2］Oakley GG，Patrick SM.Replication protein A:directing traffic at the intersection of replication and repair［J］.Front Biosci，2010，(15):883-900.

［3］Tomkiel JE，Alansari H，Tang N，et al.Autoimmunity to the M(r)32，000 subunit of replication protein A in breast cancer［J］.Clin Cancer Res，2002，8(3):752-758.

［4］Iftode C，Daniely Y，Borowiec JA.Replication protein A(RPA):the eukaryotic SSB［J］.Crit Rev Biochem Mol Biol，1999，34(3):141-180.

［5］Zhou BB，Elledge SJ.The DNA damage response:putting checkpoints in perspective［J］.Nature，2000，408(6811):433-439.

［6］Sancar A，Lindsey-Boltz LA，Unsal-Kacmaz K，et al.Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints［J］.Annu Rev Biochem，2004，(73):39-85.

［7］Burns JL，Guzder SN，Sung P，et al.An affinity of human replication protein A for ultraviolet-damaged DNA［J］.J Biol Chem，1996，271(20):11607-11610.

［8］Costa RM，Chigancas V，Galhardo Rda S，et al.The eukaryotic nucleotide excision repair pathway［J］.Biochimie，2003，85(11):1083-1099.

［9］Houtsmuller AB，Rademakers S，Nigg AL，et al.Action of DNA repair endonuclease ERCC1/XPF in living cells［J］.Science，1999，284(5416):958-961.

［10］Levidou G，Gakiopoulou H，Kavantzas N，et al.Prognostic significance of replication protein A(RPA)expression levels in bladder urothelial carcinoma［J］.BJU Int，2011，108(2 Pt 2):E59-E65.

［11］Dutta A，Ruppert JM，Aster JC，et al.Inhibition of DNA replication factor RPA by p53［J］.Nature，1993，365(6441):79-82.

［12］Givalos N，Gakiopoulou H，Skliri M，et al.Replication protein A is an independent prognostic indicator with potential therapeutic implications in colon cancer［J］.Mod Pathol，2007，20(2):159-166.

［13］Dahai Y，Sanyuan S，Hong L，et al.A relationship between replication protein A and occurrence and prognosis of esophageal carcinoma［J］.Cell Biochem Biophys，2013，67(1):175-180.