硼替佐米對小鼠骨髓樹突狀細胞的免疫調節作用及其機制探討

王瑩，梁勇，張彥明，吳德沛，劉海燕

(1蘇州大學附屬第一人民醫院，江蘇蘇州215006;2蘇州大學生物醫學研究院;3連云港市第一人民醫院;4淮安市第二人民醫院)

硼替佐米是一種蛋白酶體抑制劑，經體內外實驗研究證實，其對多種腫瘤細胞系均有抑制作用。近年來，人們發現其對免疫細胞如T細胞、NK細胞等均具有抑制作用。2013年2月～2014年6月，我們研究了硼替佐米對小鼠骨髓來源的樹突狀細胞(DC)的免疫調節作用，并探討了其作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物:SPF級C57BL/6小鼠(雄性，6～8周齡)，體質量18～22 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，層流環境下無菌飼養，每天紫外線照射消毒，飼養籠、食物、飲水均經高壓消毒。藥物與試劑:硼替佐米(楊森公司贈送)用PBS配制成2.5 mmol/L溶液，避光，于-70℃分裝保存，使用前用無血清的PRMI1640培養基稀釋為所需濃度。重組小鼠粒—巨噬細胞集落刺激因子(rmGM-CSF)購于杭州隆基生物制品公司;重組小鼠IL-4(rmIL-4)購于PeproTect公司;CCK-8試劑盒為日本同仁化學研究所產品;流式細胞術檢測所需熒光抗體均購于BD公司;ELISA試劑盒購于達科為公司;電泳遷移率分析(EMSA)試劑盒為唯奧基因公司產品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓來源DC的制備 按照Inaba等［1］的方法并加以改進。頸椎脫位法處死C57BL/6小鼠，無菌狀態下取股骨及脛骨，用1 mL注射器抽取無血清的PRMI1640培養基沖出骨髓細胞，用紅細胞裂解液(0.15 mol/L NH4Cl、0.01 mmol/L KHCO3、0.1 mmol/L EDTA-Na2)去除紅細胞并洗滌后，培養在含10%胎牛血清(GIBCO公司產品)、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、2 mmol/L谷氨酰胺及 10 ng/mL rmGM-CSF、1 ng/mL rmIL-4 的 PRMI1640培養基內，于37℃、飽和濕度、5%CO2條件下培養。48 h后，吸去懸浮細胞，僅保留貼壁細胞，加入新鮮的完全培養基及相同濃度的rmGM-CSF及rmIL-4。隔日半量換液，培養至第6天。

1.2.2 CCK-8法檢測硼替佐米對DC的抑制率于DC培養的第6天，離心收集懸浮細胞，以5×105/mL接種于96孔板，分別加入2、10、50 nmol/L的硼替佐米，同時設空白對照組，置37℃、飽和濕度、5%CO2的恒溫孵箱中培養24、48及72 h后，加入CCK-8試劑10 μL繼續培養4 h，用酶標儀在450 nm處讀取吸光度值。

1.2.3 流式細胞術檢測DC表面共刺激分子的表達 于DC培養的第6天，離心收集細胞，以1×106/mL接種于24孔板，分別加入LPS和(或)2、10、50 nmol/L的硼替佐米，繼續培養24 h，離心收集細胞，PBS洗2遍后，每管分別加入FITC標記的倉鼠抗小鼠 CD11c，抗 CD40、抗 CD80、抗 CD86、抗MHCⅡ及小鼠IgG同型對照抗體各1 μL，陰性對照管不加任何抗體。4℃避光放置30 min，加入PBS至0.5 mL，以1 500 r/min離心2 min后棄上清。PBS洗2遍，加入0.5 mL PBS吹打混勻細胞，上流式細胞儀分析。

1.2.43H-胸腺嘧核苷(TdR)摻入法觀察異基因淋巴細胞增殖情況 按上述方法培養小鼠骨髓來源的DC至第6天，收集細胞，經過 LPS和(或)2、10、50 nmol/L硼替佐米預處理24 h后，作為刺激細胞，加入濃度為25 ng/mL的絲裂霉素C，37℃孵育30 min，PBS清洗后用RPMI1640培養液重懸，DC濃度調整為 5×105/mL、1×105/mL、5×104/mL。另取BALB/C小鼠脾細胞作為反應細胞，用玻片研磨，裂解紅細胞，濃度調整為1×106/mL。兩種細胞各取100 μL于U形底96孔培養板中培養，另加rhIL-2(50 U/L)刺激培養。在混合淋巴反應體系(MLR)終止培養16 h前每孔加入培養基稀釋的3H-TdR(1 μCi/孔)10 μL。用細胞收集器將每孔培養物分別吸收在玻璃纖維濾紙上，吹風機烘干，然后將濾紙片浸入3 mL脂溶性閃爍液，置于β-液體閃爍記數儀中測定每個樣品的每分鐘脈沖數(cpm值)。

1.2.5 ELISA法檢測DC培養上清及MLR上清液中細胞因子表達 收集LPS和(或)2、10、50 nmol/L的硼替佐米作用24 h后的DC培養上清，用ELISA法檢測IL-12、TNF-α的濃度。混合淋巴細胞培養后，收集MLR培養上清，ELISA法檢測TNF-α、IFN-γ的濃度。具體方法按照試劑盒操作說明書進行。

1.2.6 電泳造移率分析法(EMSA法)檢測DC NF-κB入核活性 于DC培養的第6天，離心收集細胞，以1×106/mL接種于24孔板，分別加入LPS和(或)2、10、50 nmol/L的硼替佐米，繼續培養24 h，離心收集細胞，提取核蛋白，測定蛋白濃度，之后按照試劑盒操作說明書進行分析。

1.2.7 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。均數以±s表示，比較采用方差分析。P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 不同濃度硼替佐米在不同時間對DC的抑制作用 見表1。隨硼替佐米劑量增加及作用時間延長，對DC的抑制率升高(P均＜0.05)。

2.2 不同濃度硼替佐米對DC表面共刺激分子表達的影響 見表2。

表1 不同濃度硼替佐米在不同時間對DC的抑制作用(%，±s)

表1 不同濃度硼替佐米在不同時間對DC的抑制作用(%，±s)

注:與0 nmol/L比較，*P＜0.05;與2 nmol/L比較，aP＜0.05;與10 nmol/L比較，bP＜0.05;與24 h比較，#P＜0.05;與48 h比較，@P＜0.05。

硼替佐米 抑制率24 h 48 h 72 h 0 nmol/L 5.34± 3.20 10.13± 2.50 21.50± 4.80 2 nmol/L 30.80±37.20* 43.60±10.70*# 70.33±32.50*#@10 nmol/L 57.40±10.80*a 71.17±26.50*a# 82.37±37.60*a#@50 nmol/L 71.23±25.40*ab 83.40±31.80*ab# 85.14±36.50*ab#@

表2 不同濃度硼替佐米對DC表面共刺激分子表達的影響(%，±s)

表2 不同濃度硼替佐米對DC表面共刺激分子表達的影響(%，±s)

注:與 LPS比較，*P ＜0.05。

CD40 CD80 CD86 MHCII處理因素LPS 68.19±13.50 78.02±18.70 73.01±20.40 86.94±18.40 LPS+2 nmol/L硼替佐米 62.14±10.20 72.39±16.20 68.56±15.90 72.51±19.30*LPS+10 nmol/L硼替佐米 48.82± 9.30*47.21±13.60*42.52±10.60*68.31±20.43*LPS+50 nmol/L硼替佐米 22.03± 5.90*35.19±10.10*34.31± 6.40*35.65±12.50*

2.3 不同濃度硼替佐米處理的DC培養上清中TNF-α與IL-12水平比較 見表3。

表3 不同濃度硼替佐米處理的DC培養上清中TNF-α與 IL-12 水平比較(pg/mL，±s)

表3 不同濃度硼替佐米處理的DC培養上清中TNF-α與 IL-12 水平比較(pg/mL，±s)

注:與空白對照及LPS+0 nmol/L硼替佐米比較，*P＜0.05。

處理因素 IL-12 TNF-α 72.30± 15.70 100.09±30.60 LPS+0 nmol/L硼替佐米 467.90±132.20 814.47±93.40 LPS+2 nmol/L硼替佐米 458.54±106.40 688.22±73.60*LPS+10 nmol/L硼替佐米 121.57± 49.60* 376.56±99.90*LPS+50 nmol/L硼替佐米 22.95± 11.80* 85.69±26.80空白對照*

2.4 不同濃度硼替佐米處理的MLR培養上清INF-γ、TNF-α水平比較 見表4。

表4 不同濃度硼替佐米處理的MLR培養上清INF-γ、TNF-α 水平比較(pg/mL，±s)

表4 不同濃度硼替佐米處理的MLR培養上清INF-γ、TNF-α 水平比較(pg/mL，±s)

注:與空白對照及LPS+0 nmol/L硼替佐米比較，*P＜0.05。

處理因素 INF-γ TNF-α 13.67± 5.80 38.27± 10.50 LPS+0 nmol/L硼替佐米 276.58±60.20 574.38±107.20 LPS+2 nmol/L硼替佐米 248.32±56.40 432.57±112.50*LPS+10 nmol/L硼替佐米 196.25±73.58* 407.59± 3.40*LPS+50 nmol/L硼替佐米 68.78±26.60* 350.69± 72.60空白對照*

2.5 不同濃度硼替佐米處理的DC對異基因淋巴細胞增殖能力的影響 LPS、LPS+2 nmol/L硼替佐米、LPS+10 nmol/L硼替佐米、LPS+50 nmol/L硼替佐米處理 MLR后，3H-TdR摻入量分別為(16 843.45 ±720.50)、(14 032.36 ±716.20)、(10 341.56±538.27)、(5472.27±218.34)cpm。與單獨LPS比較，其他處理方式均導致3H-TdR摻入量減少，呈濃度依賴性(P均＜0.05)。

2.6 不同濃度硼替佐米對受DCNF-κB入核活性的影響 見圖1。經過硼替佐米預處理的imDC在LPS刺激條件下NF-κB入核量減少，并且呈現出濃度依賴性。

圖1 EMSA法檢測NF-κB入核活性

3 討論

DC是目前已知體內最重要的抗原遞呈細胞，而且也是惟一能激活初始型T細胞的抗原遞呈細胞，在特異性免疫應答的誘導中具有獨特地位［2］。im-DC位于組織和周圍淋巴器官，監視和識別外源性和內源性抗原，并通過吞噬、微吞飲和胞吞作用獲取抗原。攝取抗原后，imDC經歷成熟過程，并且向周圍淋巴器官遷移。在引流淋巴器官中，負載抗原的DC通過 MHCⅡ-抗原肽-TCR復合物活化初始 T細胞［3］。本研究發現，硼替佐米能夠抑制DC的生長，并且隨著劑量的增加及作用時間的延長，這種抑制效應也增強，呈時間、劑量依賴性。

眾所周知，T細胞的活化需兩個信號:第一信號由TCR識別APC表面的抗原肽-MHC復合物所啟動;第二信號由T細胞和APC間共刺激分子的相互作用所啟動。兩個信號的整合才可能有效地誘導T細胞活化，而缺乏共刺激信號可致T細胞應答下降，某些情況下可誘導耐受或T細胞失能［4，5］。骨髓來源的前體細胞在GM-CSF和IL-4條件下培育6 d分化成imDC，imDC可以在LPS作用下誘導成成熟DC。DC的成熟伴隨抗原遞呈分子MHCⅡ類分子和共刺激分子CD40、CD80、CD86的表達上調，黏附分子和趨化因子也能部分上調表達。本研究結果發現，骨髓源培養的DC經LPS刺激后共刺激分子(CD40、CD80、CD86)高表達，產生成熟的DC。但如果在培養的第6天中加入硼替佐米共育，則DC的成熟將受到抑制，表現為共刺激分子及MHCⅡ類分子表達下調。

DC受到病原微生物等抗原刺激后，除攝取并遞呈該抗原外，還能迅速產生并分泌大量的IL-12、TNF-α等細胞因子。IL-12作為信號分子可以促使CD+4T細胞向Th1細胞分化，從而啟動了對移植物抗宿主病(GVHD)靶器官的損傷。而TNF-α是GVHD細胞因子網絡的重要成員，除可直接引起對宿主組織的損傷外，同時能增強DC表面MHC分子和黏附分子的表達，從而大大增強供者T細胞的活化。我們發現，DC與不同濃度的硼替佐米共育后，其培養上清IL-12、TNF-α表達量降低。表明硼替佐米抑制了DC分泌細胞因子的功能。對于硼替佐米是否能影響DC活化異基因淋巴細胞的能力，我們進行了探討，結果發現經硼替佐米預處理后的DC與異基因淋巴細胞進行混合淋巴細胞培養后，異基因淋巴細胞的增殖能力明顯減弱，而培養上清內，異基因淋巴細胞分泌的TNF-α、INF-γ表達量也降低。說明由于硼替佐米抑制了DC表面共刺激分子的表達，第二信號缺失，從而影響異基因淋巴細胞充分活化增殖。

NF-κB作為核轉錄因子，在DC的發育、成熟與調節其免疫功能方面發揮重要作用。而之前有文獻報道，硼替佐米治療多發性骨髓瘤的機制之一即以時間和劑量依賴方式阻斷IκBα的降解，抑制NF-κB活性。也有文獻報道，一些免疫抑制劑可通過抑制NF-κB途徑抑制DC功能。所以我們推測，硼替佐米可能也會抑制DC中NF-κB通路，從而抑制DC的功能。本實驗結果證實了這個猜想，當經過硼替佐米預處理的imDC在加入LPS后，其NF-κB入核水平隨著硼替佐米濃度不斷升高而降低。

綜上所述，蛋白酶體抑制劑硼替佐米能夠通過抑制小鼠骨髓來源的DC內NF-κB的核轉移，影響其生長，抵抗LPS誘導的DC成熟，使DC表面共刺激分子的表達減少;同時，硼替佐米也能減弱DC的抗原遞呈能力，從而抑制了DC對異基因淋巴細胞的作用。

［1］Inaba K，Inaba M，Romani H，et al.Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor［J］.J Exp Med，1992，176(6):1693-1702.

［2］Reis E，Sousa C.Activation of dendritic cells:Translating innate into adaptive immunity［J］.Curr Opin Immunol，2004，16(1):21-25.

［3］Liu YJ.Dendritic cell subsets and lineages，and their functions in innate and adaptive immunity［J］.Cell，2001，106(3):259-262.

［4］Chen X，Murakami T，Oppenheim JJ，et al.Triptolide，a constituent of immunosuppressive Chinese herbal medicine，is a potent suppressor of dendritic-cell maturation and trafficking［J］.Blood，2005，106(7):2409-2416.

［5］Geoffrey RH，Takanori T，Vivienne I，et al.The p55 TNF-α receptor plays a critical role in T cell alloreactivity［J］.J Immunol，2000，164(2):656-663.