甘草渣總黃酮清除羥基自由基能力EPR檢測*

張 娟，卿德剛，盧景芬，倪 慧△，孫 宇，賈曉光

1新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，新疆烏魯木齊830002；

2北京大學醫(yī)學部天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室

甘草渣總黃酮清除羥基自由基能力EPR檢測*

張 娟1，卿德剛1，盧景芬2，倪 慧1△，孫 宇1，賈曉光1

1新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，新疆烏魯木齊830002；

2北京大學醫(yī)學部天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室

目的：探討甘草渣總黃酮體外對羥自由基(·OH)的清除作用。方法：利用電子順磁共振(EPR)技術檢測不同濃度甘草渣總黃酮和甘草查耳酮甲對體外·OH的清除能力。結果：甘草渣總黃酮在0.25～25mg/mL范圍內清除·OH能力隨濃度增加呈上升趨勢，且相同濃度時其清除·OH能力高于甘草查耳酮甲。結論：甘草渣總黃酮有明顯清除自由基作用，該方法、結果可作為有效活性成分的初步篩選。

甘草渣；黃酮；電子順磁共振；羥基自由基

羥基自由基是對生物體毒性最強、危害最大的一種自由基，可使組織中的糖類、氨基酸、蛋白質、核酸等物質發(fā)生氧化，遭受氧化性損傷和破壞，導致細胞壞死或基因突變等。許多藥物的作用機理與藥物清除自由基能力相關。甘草渣是脹果甘草(Glycyrrhiz inflate Bat.)生產甘草浸膏后的殘留物，含豐富的黃酮，且主要為查耳酮類［1-6］，是寶貴的可再利用資源。已有研究證實甘草總黃酮對羥自由基具有清除作用［7-8］，但是關于甘草渣黃酮清除羥自由基作用少見報道。查耳酮含還原性較強的酚羥基，本研究利用電子順磁共振(EPR)技術考察甘草渣總黃酮清除羥基自由基能力，為闡明其作用提供科學依據。

1 試劑與儀器

1.1 試劑 二甲基吡咯氮酮(DMPO)購自美國Sigma公司，使用前用活性炭純化，使之無順磁信號。水為蒸餾水，其他試劑均為分析純；甘草渣由新疆阿拉爾新農甘草產業(yè)有限責任公司提供，由本實驗室提取，經UV檢測總黃酮含量達到63%；甘草查耳酮甲為自制，經UV、IR、NMR和MS鑒定結構，含量大于95%。

1.2 儀器 ESP-300型電子順磁共振儀(德國Bruker公司)；KQ3200型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Met t ler AE163電子天平、N-1100 EYEL4旋轉蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)。

2 方法與結果

2.1 試劑的配制稱取NaCl 9.25g，KH2PO40.135g，Na2HPO4·12H2O1.425 g，將3者置100mL燒杯中，用蒸餾水溶解，以1mol/L的NaOH調pH至7.4，配制成0.05mol/L磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)。

稱取硫酸亞鐵銨［FeSO4(NH4)2SO4·6H2O］適量，用PBS配制成1.0mmol/L的溶液。DMPO的濃度為0.9mmol/L，避光冷藏。H2O2用蒸餾水稀釋至濃度6%。2.2 測定方法 甘草渣總黃酮和甘草查耳酮甲分別用PBS溶液配置成0、0.25、0.5、5、10、20 mg/mL的溶液，進行EPR測試。

2.3 羥基自由基產生體系0.05mol/L(pH=7.4)的PBS溶液，1.0 mmol/L FeSO4·(NH4)2SO4·6H2O溶液，0.9mmol/LDMPO溶液，6%H2O2溶液。以上4種試劑各取5μL注入EP管，混勻后快速裝入石英毛細管中，然后外加樣品保護測試管，一并放入EPR波譜儀諧振腔中進行測定，作為對照樣品。樣品測定時分別用樣品液代替PBS溶液。

2.4 EPR測試參數中心磁場(CF)：344.5mT；掃描寬度(SW)：10mT；掃描時間(ST)：60S；調制幅度(MA)：0.25mT；調制頻率(MF)：100 KHz；微波頻率(MF)：9.697GHz；微波功率(MP)：20mW；測試溫度(T)：室溫。

2.5 清除率計算I=(h0-hx)/h0×100%，h0表示空白體系中EPR譜信號強度測量平均值，hx為樣品體系中EPR譜信號強度測量平均值，I值越大清除羥自由基能力越強，結果見圖1。

圖1 不同濃度甘草渣總黃酮和甘草查耳酮甲清除羥基自由基能力趨勢圖

3 討論

本實驗室建立了總黃酮提取方法，經UV檢測總黃酮含量達63%。EPR研究表明，該甘草渣總黃酮在0.25～25mg/mL濃度范圍內清除·OH自由基能力隨濃度增加呈上升趨勢，且在低濃度0.25mg/mL時對·OH自由基清除率已達50.53%，一般認為對自由基的清除率達到50%即有較好的清除作用。甘草渣總黃酮中甘草查耳酮甲含量最高［2］，故對其進行研究，結果顯示相同濃度下甘草渣總黃酮清除羥基自由基能力優(yōu)于甘草查耳酮甲，這可能是甘草渣中多種黃酮類物質協同作用的結果，其中是否存在其他具有清除自由基能力的物質或者增效物質，有待進一步考察。

EPR技術是利用具有未成對電子物質在磁場作用下吸收電磁波能量而完成電子能級間躍遷的特性，對順磁性物質進行檢測和分析的方法，具有靈敏度高、樣品不受破壞和無干擾等優(yōu)點，是目前檢測自由基最直接、最有效的方法之一。本研究利用Fe2+經H2O2氧化成Fe3+，并產生短壽命的羥自由基，被自旋捕捉劑DMPO捕捉后，經電子順磁共振儀檢測，得到羥基自由基的特征譜圖［9］。該方法快速靈敏，可用于體外對藥物活性成分的初步篩選［9］。

［1］ 張娟，卿德剛，倪慧，等.甘草廢渣中黃酮類化合物的分離及鑒定［J］.中國中醫(yī)藥科技，2009，16(2)：127-128.

［2］ 張娟，倪慧，卿德剛，等.HPLC法指認甘草廢渣中黃酮類成分及含量測定［J］.中國中醫(yī)藥科技，2012，19(3)：233-234.

［3］張娟，劉芬，李寧，等.UPLC-TOP-MS法鑒定脹果甘草藥渣中黃酮類成分［J］.現代藥物與臨床，2012.27(6)：558-561.

［4］ 李寧，劉芬，倪慧，等.新疆脹果甘草化學成分的分離與鑒定［J］.沈陽藥科大學學報，2011，28(5)：368-370.

［5］ 陳超，李寧，倪慧，等.甘草化學成分分離、細胞培養(yǎng)和分析研究進展［J］.現代藥物與臨床，2011，26(3)：188-194.

［6］ 劉芬，李寧，倪慧，等.甘草藥渣的研究進展［J］.中國現代中藥，2011，13(2)：6-9.

［7］ 吳碧華，龍存國，王曉明，等.甘草總黃酮清除羥自由基作用的體外實驗探討［J］.川北醫(yī)學院學報，2001，16(1)：3-5.

［8］Zhu SH，He Q，Gong YH，et al.Ef fects of Glycyr rhiza f lavonoid on f ree radical in duced brain lipid peroxident［J］.Pacta Univ Med Tongji，1994，23(2)：125-127.

［9］LU Jingfen，Mutel iefu Gulinuer，LI Tingfeng.Studies of antioxidation activity of natuial products with EPR methods［J］.Chinese Journal of Magnetic Resonance，2010，27(1)：22-31.

Scavenging Effectof Total Flavonoids from Glycyrrhiza Residues on HydroxylRadicalby EPRDeterm ination

ZHANG Juan1,QING Degang 1,LU Jingfen2,NIHui1△,SUN Yu1,JIA Xiaoguang1
1 Xinjiang Institute of Chinese Materia Medica and EthicalMateria Medica,Urumqi830002,China;
2 State Key Laboratory of Natural and Biomimetic drugs in Health Science Center of Peking University

Objective:To study the functions of total flavonoids in glycyrrhiza residues to scavenge hydroxyl radical(·OH).Methods:Scavenging effects of total flavonoids and licochalcone from glycyrrhiza residues in different concentrations on hydroxyl radical in vitro were detected by electron paramagnetic resonance(EPR). Results:As the concentrationsof total flavonoids from glycyrrhiza residues increased,scavenging effectswere raised when total flavonoids from glycyrrhiza residueswere between 0.25 and 25mg/mL,and the capacity of eliminating hydroxyl radical was higher than licochalcone when they were at the same concentration.Conclusion:Total flavonoids in glycyrrhiza residues could scavenge hydroxyl radicalobviously,and themethod could be taken as the firststep to screen active ingredients.

glycyrrhiza residues;flavonoids;electron paramagnetic resonance;hydroxyl radical

R284.1

A

1004-6852(2015)01-0011-02

2013-12-04

新疆維吾爾自治區(qū)衛(wèi)生廳青年科技人才專項科研項目(編號2012Y06)。

張娟(1983—)，女，助理研究員。研究方向：天然藥物的分析及制劑研究。

△通訊作者：倪慧(1964—)，女，碩士研究生導師，研究員。研究方向：天然藥物的分析及制劑研究。