中電導鈣激活鉀通道（IKCa通道）在HeLa細胞中的表達及其對細胞增殖的影響*

范凌曄，石磊，詹平，劉玲，聶丹，毛熙光

論著

中電導鈣激活鉀通道（IKCa通道）在HeLa細胞中的表達及其對細胞增殖的影響*

范凌曄，石磊1，詹平，劉玲，聶丹，毛熙光

（瀘州醫學院附屬醫院：婦產科；1人力資源部，四川瀘州646000）

目的：本研究旨在探討中電導鈣激活鉀通道（IKCa通道）在宮頸癌HeLa細胞中的表達及其對細胞增殖的作用。方法：以宮頸癌HeLa細胞株為研究對象，構建包含IKCa通道特異性shRNA片段的pGenesil-IK質粒；運用熒光定量PCR和Western Blotting比較pGenesil-IK質粒轉染干預前后宮頸癌HeLa細胞中IKCa通道基因和蛋白表達水平的變化；運用WST-1檢測技術和流式細胞術觀察轉染干擾質粒后對HeLa細胞增殖的影響。結果：①轉染pGenesil-IK干擾質粒后HeLa細胞IKCa通道mRNA及蛋白表達水平較對照組顯著降低（P＜0.05）。②轉染pGenesil-IK1干擾質粒顯著抑制HeLa細胞增殖和細胞周期（P＜0.05）。結論：宮頸癌HeLa細胞上有較高的IKCa通道表達，抑制宮頸癌HeLa細胞株IKCa通道表達能有效抑制癌細胞增殖，提示IKCa通道可能是宮頸癌的治療靶點之一。

宮頸癌曰中電導鈣激活鉀通道曰RNA干擾曰細胞增殖

宮頸癌（cervical cancer）是一種嚴重危害婦女健康的全球性疾病，在婦科腫瘤中位居第二。目前針對宮頸癌發病以及浸潤轉移機制尚未完全闡明[1]。我們知道細胞正常電生理結構以及功能的改變往往導致疾病的發生，甚至腫瘤的形成。作為鈣激活鉀離子通道家族成員之一的中電導鈣激活鉀通道（IKCa通道），在人體許多惡性腫瘤中出現高表達，并參與了腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移[2-5]。然而IKCa通道是否參與宮頸癌的發生尚未見報道。故本研究觀察IKCa通道在HeLa細胞中的表達及下調IKCa通道后對HeLa細胞增殖的影響，探討IKCa通道在宮頸癌發病中作用以及意義。

1 材料和方法

1.1 實驗分組和RNA干擾質粒構建

本實驗中的宮頸癌HeLa細胞株由重慶醫科大學病理學實驗室饋贈。實驗分為4組：空白對照組（Control）：不轉染IKCa通道干擾質粒的的HeLa細胞；陰性對照組：轉染含有亂序的對照干擾質粒pGenesil-HK的HeLa細胞；pGenesil-IK1組和pGenesil-IK2組：分別轉染含有兩個不同的IKCa通道干擾序列的HeLa細胞。RNA干擾質粒構建采用從GeneBank數據庫中搜索得到IKCa通道的基因序列（NM-002250），選擇設計兩條shRNA和一條隨機重排而成的陰性對照,所篩選出的基因靶序列1（1360-1380）模板為（GCCTGGATGTTCTACAAACAT）；靶序列2（1512-1532）模板（CAAGATGCACATGATCCTGTA）；陰性對照（GCCTGGATGTTCTACAAACAT），分別構建shRNA真核表達質粒命名為pGenesil-IK1，pGenesil-IK2，pGenesil-HK（由上海吉凱公司合成）。

1.2 實驗方法

1.2.1 HeLa細胞培養和轉染

將細胞懸液轉入含10%小牛血清RPMI-1640（Hyclone，美國）培養基中，在37℃、5%CO2的培養箱內培養。用脂質體LipofectamineTM2 000轉染細胞（Invitrogen，美國），轉染步驟按照操作說明書進行。

1.2.2 熒光定量PCR實驗

采用Taqman探針法檢測IKCa通道基因表達。用Primer Premier 5.0軟件設計PCR擴增引物及TaqMan探針序列（由上海吉凱公司合成），如表1所示，以GAPDH作為內參照基因。通過總RNA提取，逆轉錄得到cDNA，之后進行Real-time PCR反應。反應體系為：模板cDNA 5μL，10×PCR Buffer 10 μL，25 mM MgCl25μL，2.5 mM 4 dNTP混合液8 μL、0.5μM上下游引物各1μL、Taq DNA Polymerse（5 U/μL）1μL、加H2O使總反應體系為100μL；退火溫度為55℃。反應循環數40個循環。

表1 Taqman法熒光定量PCR引物和探針序列

1.2.3 Western Blotting實驗

蛋白的提取按凱基全蛋白提取試劑盒說明進行，測定蛋白濃度后，調整樣品濃度，每個泳道加入的總蛋白量為30μg。按照Western Blotting方法進行，包括SDS-PAGE電泳、轉膜和封閉。一抗（兔抗IKCa抗體，稀釋比例1∶1 000；小鼠抗GAPDH抗體，稀釋比例1∶20 000，北京依瑪博科技有限公司）4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記二抗（分別羊抗兔二抗和羊抗小鼠二抗，稀釋比例為1∶5 000，北京依瑪博科技有限公司）室溫孵育1 h，之后顯影并進行灰度值分析。

1.2.4 細胞增殖和細胞周期實驗

每組20孔，每個時間點設5個復孔。于轉染后21、45、69、93 h分別往每孔中加入10μL的WST-1繼續培養3 h，將96孔板置于搖床上搖動1 min，以充分混勻待檢測體系。使用用酶標儀分別測定轉染24、48、72、96 h后各孔450 nm處吸光度值。計算同組處理樣品吸光度平均值，繪制細胞生長曲線，統計分析。

1.2.5 細胞周期實驗

于轉染48 h后收集細胞，PBS洗滌細胞一次（離心2000 r/min，5 min）調整細胞濃度為1×106/ mL，用70%乙醇4℃固定24 h，染色前用PBS洗去固定液，加入100μL RNaseA 37℃水浴30 min，再加入碘化丙啶（PI）溶液400μL染色混勻，4℃避光30 min后，在流式細胞儀上進行檢測分析。使用流式細胞術進行檢測分析。計算增殖指數（PI）%=（S+G2）/（G1+S+G2）×100%。

1.3 統計學分析

計量資料采用均數±標準差（x±s）表示。組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）。統計學處理采用SPSS16.0軟件進行，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 IKCa通道干擾質粒在HeLa細胞上的表達

IKCa通道干擾質粒轉染HeLa細胞24 h后的熒光顯微鏡觀察結果，如圖1所示。從圖中可以看出，轉染后含有GFP標簽的對照質粒pGenesil-HK和IKCa通道干擾質粒pGenesil-IK1均能在HeLa細胞上表達，具有較高的轉染效率（大于70%）。轉染干擾質粒pGenesil-IK2的結果與pGenesil-IK1結果類似。2.2 Q-PCR檢測HeLa細胞IKCa通道mRNA表達水平

圖1 IKCa通道干擾質粒在HeLa細胞上的表達（×200）

以未轉染的HeLa細胞為對照組（Control），各處理組IKCa和內參GAPDH的CT值、ΔCt值、ΔΔCt值（處理組ΔCt值-Control組ΔCt值）及倍數關系如表2所示。轉染48 h后，pGenesil-IK1組、pGenesil-IK2組、pGenesil-HK組、Control組的ΔCt分別為9.81± 0.28，9.40±0.80，8.79±0.28，7.93±0.29。pGenesil-IK1組、pGenesil-IK2組表達水平明顯低于pGenesil-HK組和Control組，差異有統計學意義（P＜0.05）。pGenesil-HK組與Control組IKCamRNA表達無統計學差異（P＞0.05），pGenesil-IK1組與pGenesil-IK2組IKCa mRNA表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 IKCa通道干擾質粒對IKCa和GAPDH的CT，ΔCt和ΔΔCt的影響（n=3,x±s）

2.3 IKCa通道干擾質粒對HeLa細胞IKCa蛋白表達的影響

IKCa通道干擾質粒對HeLa細胞IKCa蛋白表達影響如圖2所示。從圖中可以看出，對照質粒pGenesil-HK對HeLa細胞IKCa通道表達沒有明顯影響（P＞0.05）。而與對照組相比，干擾質粒pGenesil-IK1和pGenesil-IK2均能明顯下調HeLa細胞IKCa通道蛋白表達水平。相對表達量分別由1.30±0.15（Control，n=5）下降到0.77±0.12（pGenesil-IK1，n=5）和0.74±0.13（pGenesil-IK2，n=5），差異具有統計學意義（P＜0.05）。而干擾質粒pGenesil-IK1和pGenesil-IK2之間對IKCa通道蛋白表達量影響無統計學差異。

圖2 IKCa通道干擾質粒對HeLa細胞IKCa蛋白表達的影響

2.4 IKCa通道干擾質粒對HeLa細胞增殖的影響

在本實驗中應用WST-1檢測轉染IKCa通道干擾質粒對HeLa細胞增殖的影響。結果發現，隨著時間的延長，各組細胞OD值呈進行性升高，但是pGenesil-IK1組較pGenesil-HK組和HeLa細胞空白對照組（Control）升高幅度?。ㄒ姳?）。在24、48、72、96 h 4個時間點，pGenesil-IK1組細胞生長和增殖速度明顯減緩，與pGenesil-HK組和HeLa空白對照組細胞相比，差異具有統計學意義（P＜0.05），而pGenesil-HK組和Control組在各個時段細胞增殖活性無明顯差異（P＞0.05），提示IKCa通道下調能有效抑制宮頸癌HeLa細胞增殖。

表3 WST-1檢測IKCa通道干擾質粒對HeLa細胞增殖的影響（n=5,x±s）

2.5 IKCa通道干擾質粒對HeLa細胞周期的影響

流式細胞儀分析細胞周期發現，與HeLa細胞空白對照組（Control）和pGenesil-HK質粒轉染組相比，pGenesil-IK1質粒轉染組HeLa細胞G0/G1期細胞增加，S期細胞減少，細胞被阻滯在G1期，結果具有統計學意義（P＜0.05）。從表4中可以看出，Control組和pGenesil-HK組HeLa細胞G0/G1期比率分別是（48.8±0.2）%和（49.6±0.3）%，而pGenesil-IK1組G0/G1期為（53.0±1.8）%，與Control組和pGenesil-HK組相比，結果具有統計學意義（P＜0.05）。Control組和pGenesil-HK組HeLa細胞S期比率是（31.5±1.5）%和（32.8±0.6）%，轉染質粒pGenesil-IK1組比率則分別為（28.6±0.9）%，與細胞對照組（HeLa）和pGenesil-HK組相比，S期細胞減少，差異具有統計學意義（P＜0.05）。計算細胞增殖指數PI發現：轉染了pGensil-IK1質粒的HeLa細胞增殖指數為（45.0±1.8）%，而空白對照組（HeLa）和質粒對照組（pGenesil-HK）增殖指數分別為（50.2 ±0.1）%，（49.3±0.4）%，與對照組細胞相比，差異具有統計學意義（P＜0.05）。這些結果提示，表達IKCa通道shRNA重組質粒的轉染抑制了細胞增殖，使細胞生長停滯于G0/G1期。

表4 流式細胞術檢測IKCa通道干擾質粒對HeLa細胞周期的影響（%，n=5，x±s）

圖3 IKCa通道干擾質粒對HeLa細胞周期影響的流式細胞檢測圖

3 討論

IKCa通道屬于鈣激活鉀通道家族成員之一，主要存在于一些非興奮性細胞中，參與細胞鈣離子內流、膜電位、增生、凋亡和分泌等各種生理活動的調節[6-7]。IKCa通道的激活可導致細胞膜長期處于超極化狀態，形成細胞內外電位差，這種電位差能促使對電位敏感的鈣離子通過細胞膜進入細胞內，產生復雜的細胞內信號傳導的級聯反應，從而對細胞的功能產生的影響。研究提示IKCa通道功能的改變參與了包括腫瘤在內的多種疾病的發生[8-9]。既往研究發現，IKCa在乳腺癌和前列腺癌的發生發展及侵襲中有非常重要的作用[10-11]。上述的研究證實了IKCa通道在腫瘤中占有重要的地位和作用，在我們的研究中，我們運用PCR和Western Blotting從基因和蛋白兩方面證實HeLa細胞中存在IKCa通道的表達，也為下一步研究其在宮頸癌中的作用和意義奠定基礎。

腫瘤細胞的增殖是腫瘤生長和侵襲的重要基礎，我們知道細胞增殖依賴于細胞周期蛋白的調節，細胞周期的長短取決于G0/G1期的時間，G0/G1期時間越短，細胞的周期就越短，細胞增殖速度就越快。在人前列腺癌細胞研究中，Lallet-Daher等[11]發現，用IKCa的特異性阻斷劑TRAM-34阻斷IKCa可使細胞膜去極化，鈣離子內流減少，細胞增殖周期減慢并停滯于G0/G1期；用IKCa的特異性阻斷劑TRAM-34及其靶向siRNA阻斷LNCaP和PC-3細胞的IKCa表達后，可導致細胞周期依耐性激酶抑制因子（CDKIS）p21Cip1蛋白蓄積。這些研究提示鉀離子通道通過調控癌細胞的生長周期進程進而調控腫瘤的增殖和凋亡。目前，如何阻斷HeLa細胞的增殖過程，延緩宮頸癌的生長是目前研究宮頸癌的熱點[12]。在其他腫瘤中，使用TRAM-34或者RNA干擾阻斷IKCa表達后能顯著阻斷腫瘤細胞的增殖。在本實驗中，我們在檢測IKCa通道在HeLa細胞上表達的基礎上，通過干擾技術敲除IKCa表達后進一步發現：敲低IKCa通道表達能使HeLa細胞增殖指數（PI）明顯降低，細胞周期停滯于G0/G1期。隨后采用WST-1法分析發現在IKCa通道干擾質粒轉染HeLa細胞后HeLa細胞生長增殖受到了嚴重的抑制殖。然而對于其中的具體的分子機制我們將在進一步的實驗研究中闡述。

綜上所述，宮頸癌HeLa細胞上有較高的IKCa通道表達，抑制宮頸癌HeLa細胞株IKCa通道表達能有效抑制癌細胞增殖，提示IKCa通道可能是宮頸癌的治療靶點之一。

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（2015-01-13收稿）

Objective:To detect the expression of intermediate conductance calcium activated potassium channel in cervical cancer cell lines（HeLa）,and to observe the effect of blocking IKCachannels on cell proliferation and cycle.Methods：The plasmid of pGenesil-IK containing of IKCaspecific shRNA fragment channelwas transfected into HeLa cells.The combined use offluorescence quantitative PCR and Western blotting were used to investigate the gene and protein expression level of IKCachannels.The effect of IKCachannels on the proliferation of HeLa cells was investigated by WST-1 and flow cytometry.Results：①After transfection with the interference plasmid of pGenesil-IK1,IKCa channel mRNA and protein expression levels in the HeLa cells were lower than in the control group（P＜0.05）.②The cell cycle was inhibited by transfection with the interference plasmid of pGenesil-IK1（P＜0.05）.Conclusion:IKCachannels are highly expressed in cervical cancer HeLa cells.Inhibiting expression of IKCachannel can effectively inhibit,cell proliferation of HeLa cells, which suggested that IKCachannels may be one of the targets in the treatmentofcervical cancer.

Cervical cancer;Intermediate conductance calcium activated potassium channel；RNA interference;Cellproliferation

R737.33

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2015.03.001

*四川省科技廳應用基礎項目（No:2008JY0014-1）

范凌曄（1978-），女，助教

毛熙光（196-），男，教授。E-mail：maoxiguang6639@163.com

Expression of intermediate conductance Ca2+-activated K+channels(IKCachannels)in HeLa cells and its role in cell proliferation

Fang Lingye,Shi Lei1,Zhan Ping,Liu Ling,Nie Dan,Mao Xiguang

Department of Gynaecology and Obstetrics;1Department of Human Resource，the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College