Sysmex血凝儀在冷沉淀質(zhì)量檢測(cè)中的應(yīng)用

秦艷蘭，葉柱江，何子毅

(東莞市中心血站，廣東 東莞523930)

冷沉淀制品含F(xiàn)Ⅷ 、纖維蛋白原、血管性血友病因子、和纖維結(jié)合蛋白。臨床上主要用于血友病A、血管性血友病及纖維蛋白原、因子X(jué)Ⅲ或纖維結(jié)合蛋白量的減少或質(zhì)的缺陷引起出血的患者，期望通過(guò)補(bǔ)充外源性的凝血因子達(dá)到止血的目的

[1]。目前冷沉淀產(chǎn)品的質(zhì)量檢測(cè)主要是依靠全自動(dòng)血凝儀，由于血凝儀檢測(cè)的凝血因子Ⅷ屬因子活性或時(shí)間檢測(cè)，定量參數(shù)較少，檢測(cè)項(xiàng)目的影響因素多，再加上試驗(yàn)未標(biāo)準(zhǔn)化，缺乏國(guó)際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)品和參考方法，其影響因素具有特殊性。當(dāng)其啟動(dòng)因子被某些因素激活后，就會(huì)發(fā)生一系列連鎖反應(yīng)，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的極大誤差。為了保證檢測(cè)質(zhì)量，在每一次檢測(cè)時(shí)確保儀器性能處于良好狀態(tài)顯得至關(guān)重要。為了探討本血站現(xiàn)有的采供血模式所制備的冷沉淀的質(zhì)量是否符合 《全血及成分血質(zhì)量要求》(GB18469-2012)，在確保儀器性能良好的狀態(tài)下檢測(cè)了97份冷沉淀產(chǎn)品，對(duì)其中的因子Ⅷ 、纖維蛋白原含量進(jìn)行了檢測(cè)和分析，現(xiàn)將其結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 評(píng)價(jià)樣品 西門(mén)子公司正常定值血漿 (批號(hào)503174)Ⅷ含量：靶值 100%，范圍80%~120%；纖維蛋白原(Fg)含量：靶值2.4g/L,范圍 1.9~2.9g/L；低值定值血漿(批號(hào)509946)Ⅷ含量：靶值31%，范圍23%~39%；纖維蛋白原(Fg)含量：靶值1.0g/L，范圍0.6~1.4g/L。

1.2 抽檢樣品 獻(xiàn)血服務(wù)科按《獻(xiàn)血者健康檢查要求》(GB18467-2011)采集自愿無(wú)償獻(xiàn)血者血液，抗-HCV、HBsAg、抗-HIV、梅毒抗體和轉(zhuǎn)氨酶(ALT)檢測(cè)合格，成分制備組用虹吸法制備的冷沉淀。

1.3 儀器與試劑 Sysmex血凝儀CA－500 (日本)，活化部分凝血活酶時(shí)間測(cè)定試劑 (APTT批號(hào)R2011)，乏Ⅷ因子血漿 (批號(hào) 546572)，CaCl2試劑(批號(hào) R3001)， Fg 試劑(批號(hào) R3003)，定標(biāo)血漿 Ⅷ因子含量97%,Fg含量2.45g/L(批號(hào)503227A)試劑全部為西門(mén)子公司出品，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書(shū)操作。

1.4 方法

1.4.1 精密度評(píng)價(jià) 根據(jù)NCCLSEP15-A文件對(duì)精密度評(píng)價(jià)的要求，批內(nèi)精密度：取一個(gè)正常水平的定值質(zhì)控血漿和一個(gè)低值水平的定值質(zhì)控血漿，復(fù)溶后按儀器的操作規(guī)程連續(xù)重復(fù)分別測(cè)定Ⅷ和Fg20次，計(jì)算平均值(x),標(biāo)準(zhǔn)差(SD)及變異系數(shù)(CV)，CV<5%為精密度符合要求。批間精密度 ：取復(fù)溶后的正常水平的定值質(zhì)控血漿和低值水平的定值質(zhì)控血漿，每天上午下午各測(cè)定1次，連續(xù)10d，分別計(jì)算其平均值(x),標(biāo)準(zhǔn)差(SD)及變異系數(shù)(CV)，判斷標(biāo)準(zhǔn)CV<5%為批間精密度符合要求。

1.4.2 準(zhǔn)確度評(píng)價(jià) 取一個(gè)正常水平的定值質(zhì)控血漿和一個(gè)低值水平的定值質(zhì)控血漿，分別測(cè)定Ⅷ和Fg含量，在血凝儀上重復(fù)檢測(cè) 20次 ，分別計(jì)算其均值然后和各自的靶值進(jìn)行比較觀察其一致性、其偏差是否在允許范圍內(nèi)[2]。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 在確認(rèn)儀器的精密度和準(zhǔn)確度符合要求的情況下，用定標(biāo)血漿按儀器要求和操作說(shuō)明書(shū)制作以X軸為活性(濃度)，Y軸為凝固時(shí)間(反應(yīng)速度)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 室內(nèi)質(zhì)控圖的建立和應(yīng)用 在本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)條件下，對(duì)同一批號(hào)正常水平的定值質(zhì)控血漿按操作說(shuō)明書(shū)分別連續(xù)測(cè)定其Ⅷ和Fg20次，獲取Ⅷ和Fg二組數(shù)據(jù)，分別計(jì)算其均值x和標(biāo)準(zhǔn)差SD，以此數(shù)據(jù)建立Ⅷ和Fg質(zhì)控框架圖。在以后的樣品檢測(cè)中用該質(zhì)控品隨樣品一同檢測(cè)，并將測(cè)得的質(zhì)控值點(diǎn)入質(zhì)控框架圖中，檢測(cè)結(jié)果進(jìn)入質(zhì)控狀態(tài)，凡超過(guò)2SD的數(shù)據(jù)為告警;超過(guò)3SD的數(shù)據(jù)為失控，本次實(shí)驗(yàn)需進(jìn)行重做[3]。

1.4.5 冷沉淀中的凝血因子Ⅷ、纖維蛋白原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)GB18469－2012《全血及成分血質(zhì)量要求》：來(lái)源于 400ml全血：。1.4.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”(x±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 精密度評(píng)價(jià)結(jié)果 Sysmex全自動(dòng)血凝儀(型號(hào)CA－500)檢測(cè)正常水平的定值質(zhì)控血漿和低值水平的定值質(zhì)控血漿其批內(nèi)精密度見(jiàn)表1。所測(cè)得的兩個(gè)水平的血漿批內(nèi)和批間CV值均<5.0%。

表1 Sysmex血凝儀批內(nèi)和批間精密度(n=20)

2.2 準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)結(jié)果 根據(jù)NCCLS(美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì))的要求，Ⅷ因子和Fg總允許誤差<10%。檢測(cè)兩個(gè)定值血漿結(jié)果與各自靶值相比，偏差均在允許誤差范圍內(nèi)。

2.3 冷沉淀FⅧ、Fg檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

表2 冷沉淀制品FⅧ含量(n=97)

表3 冷沉淀制品Fg含量(n=97)

3 討論

為了保證血液產(chǎn)品質(zhì)量確保輸血安全有效,按照《血站技術(shù)操作規(guī)程》(2012版)的要求及《全血及成分血質(zhì)量要求》(GB18469-2012),每月對(duì)冷沉淀制品FⅧ因子和纖維蛋白原進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)測(cè)。為了準(zhǔn)確反映冷沉淀制品的質(zhì)量，在進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)時(shí)為了得到準(zhǔn)確可靠的結(jié)果，檢測(cè)儀器的性能須處在最佳狀態(tài)。

Sysmex血凝儀是用于監(jiān)測(cè)冷沉淀質(zhì)量的專(zhuān)用儀器，F(xiàn)g定量檢測(cè)方法Clauss法是WHO推薦的參考方法[5]；Clauss法的原理是在標(biāo)本中加入過(guò)量凝血酶，使Fg轉(zhuǎn)變成纖維蛋白而凝固，F(xiàn)g的含量與出現(xiàn)凝固的時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，能直接反應(yīng)Fg在冷沉淀中的含量。

盡管廠家已經(jīng)提供了儀器性能的初步參數(shù)，但由于地區(qū)、人種、實(shí)驗(yàn)室之間的差異，特別是某些試劑制備、批號(hào)改變后性能會(huì)有顯著改變，各實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)使用前應(yīng)重新評(píng)估，按照NCCLS有關(guān)文件要求進(jìn)行評(píng)估。本次結(jié)果顯示，該儀器兩個(gè)項(xiàng)目正常和異常水平的質(zhì)控品批內(nèi)和批間的精密度均<5%，具有良好的精密度，檢測(cè)穩(wěn)定性好；準(zhǔn)確度高，系統(tǒng)誤差小，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，與其它品牌血凝儀檢測(cè)結(jié)果可比[6]。

儀器除了日常保養(yǎng)和特殊維護(hù)外，在分析檢測(cè)前，下面的一些因素也要考慮：試劑從冰箱拿出室溫恒定后再?gòu)?fù)溶，試劑復(fù)溶時(shí)水或稀釋劑加量一定要準(zhǔn)確，并混合均勻，放置 5～10min后再將試劑預(yù)溫，復(fù)溶后的試劑應(yīng)在試劑規(guī)定的穩(wěn)定期使用，否則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；試劑杯混入灰塵，有可能堵塞吸樣針，影響儀器的吸液量，反應(yīng)杯進(jìn)入灰塵會(huì)影響結(jié)果的判讀。在更換試劑批號(hào)后，應(yīng)重新用定標(biāo)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線以保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性。每次檢測(cè)時(shí)，用正常水平的定值質(zhì)控血漿和低值水平的定值質(zhì)控血漿與樣品同行檢測(cè)。該質(zhì)控品最好使用與試劑同一廠家，有的進(jìn)行了自制凝血質(zhì)控品用于室內(nèi)質(zhì)控的研究[7]。影響檢驗(yàn)結(jié)果質(zhì)量的因素是多方面的，這些檢驗(yàn)前的分析直接影響檢驗(yàn)的質(zhì)量，是保證檢測(cè)質(zhì)量的前提[8]。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，97袋冷沉淀中Ⅷ含量低于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(80IU)的有4袋、占4.12%；合格的有93袋，F(xiàn)Ⅷ含量多集中在81IU到160IU之間，占81.5%，160IU以上的占14.4%合格率為95.9%。Fg含量低于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(150mg)的有3袋，占3.1%；合格的有94袋，含量多集中在151mg到300mg之間，占85.58%，300mg以上的有11袋占11.3%。通過(guò)抽檢了解到冷沉淀FⅧ因子含量及纖維蛋白原含量均有不合格情況存在，抽檢的97袋冷沉淀總合格率(90/97)為92.8%，有7.2%的不合格率。本次實(shí)驗(yàn)的冷沉淀是用虹吸法制備，虹吸法在原料新鮮冰凍血漿融化過(guò)程中，部分冷沉淀不能形成大的凝聚團(tuán)塊或絮狀，無(wú)法聚集吸附在中央未融化的冰碴上或袋壁上，有部分散在的細(xì)小冷沉淀由于虹吸作用直接流到另一冷上清轉(zhuǎn)移空袋中，另外，由于虹吸法制備冷沉淀時(shí)，原料血漿融化的速度不一致，部分血漿融化為少量冷不融物的時(shí)間較為集中，工作人員來(lái)不及取出部分冷沉淀袋，致使袋內(nèi)的少量冷不融物繼續(xù)融化，甚至完全融化而直接流入冷上清的轉(zhuǎn)移袋內(nèi)[9]。冷沉淀中的Ⅷ是一種極不穩(wěn)定的凝血因子，受到制備程序的影響很容易失去活性，為獲得較高活性的FⅧ，控制新鮮冰凍血漿融化時(shí)溫度和融化時(shí)間很重要，融化血漿時(shí)，溫度必須控制在4℃左右，超過(guò)8℃則冷沉淀將復(fù)溶，回收率降低[10]。

采用Sysmex血凝儀對(duì)冷沉淀制品中FⅧ因子和Fg進(jìn)行監(jiān)測(cè),并加強(qiáng)了對(duì)采血、成分制備、貯存及運(yùn)輸全過(guò)程的全面質(zhì)量監(jiān)督,能有效地控制了新鮮冰凍血漿、冷沉淀制品的質(zhì)量,保證了合格、安全有效的血液制品應(yīng)用于臨床。

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