洗液對ELISA法檢測梅毒螺旋體特異性抗體結果的影響

閆朝春

(連云港市東方醫院檢驗科，江蘇 連云港222042)

酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)由于靈敏度高、特異性強、重復性好、操作簡單且不需要特別昂貴的儀器設備而被臨床實驗室廣泛應用[1，2]，目前梅毒螺旋體特異性抗體 (Treponema pallidum specific antibody,TPAb)的檢測大多就采用此方法。ELISA法是一種固相載體包被的免疫標記檢驗技術，其本身存在諸多影響因素，如標本處理、試劑盒選擇、溫育條件、洗板方式等等[3，4]，一旦哪一步操作不好，結果就有可能產生偏差。本文就ELISA法檢測TP-Ab試驗中的洗液對檢驗結果的影響進行了一番探討，旨在尋找最佳的洗滌方式，以便規范試驗操作,提高檢測結果的準確性和可靠性。

1 材料與方法

1.1 標本的選擇 選取TP-Ab陽性標本68例(OD>1.000)，陰性標本 24 例(OD<0.010)，標本均無溶血和脂血。

1.2 試劑與儀器 試劑為北京萬泰生物藥業股份有限公司生產的梅毒螺旋體抗體診斷試劑盒(酶聯免疫法)，批號為 N20140203，有效期為 2015-01；儀器為Addcare ELISA 600型酶免分析工作站，由煙臺艾德康生物科技有限公司提供；質控品購自江蘇省臨床檢驗中心，規格為12mIU(2NCU)/ml，批號為201311003。

1.3 實驗方法 將選取的臨床陽性標本用混合血清(OD小于0.005)稀釋至S/CO于0.8~1.3范圍內進行試驗，分別用蒸餾水、純凈水和自來水配制三種洗液，以平行試驗改變三種洗液對92例樣本(陰性24例，弱陽性42例，強陽性26例)進行平行試驗。并以蒸餾水將洗液配制成不同濃度(濃度1：1:5，濃度 2：1:20，濃度 3：1:40，濃度 4：1:80)對 92 例樣本(陰性24例，弱陽性42例，強陽性26例)進行試驗。洗板過程中注液體積為350μl,均浸泡30s。

1.4 統計處理 結果在Stata 9.2統計軟件包上進行處理，計量資料均數比較采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同水質的洗液對ELISA法檢測TP-Ab結果的影響 純凈水組與蒸餾水組弱陽性標本的S/CO值比較無統計學差異(P>0.05)，自來水組弱陽性標本的S/CO值高于蒸餾水組(P<0.05)，詳見表1；自來水組的陽性率分別高于蒸餾水組和純凈水組(P<0.05)，而純凈水組與蒸餾水組檢測陽性率無統計學差異(P>0.05)，詳見表 2。

2.2 以蒸餾水配制不同濃度的洗液對ELISA法檢測TP-Ab結果的影響 高濃度的洗液造成試驗結果OD值偏低，陽性率降低；低濃度的洗液則使OD值升高，陽性率升高。結果詳見表3和表4。

2.3 不同洗液對ELISA法檢測梯度濃度TP-Ab質控結果的影響 自來水配制的洗液結果高于蒸餾水，蒸餾水配制的洗液以1:20為標準，濃度越高，OD值偏低，濃度越低，OD值偏高。結果詳見表5。

表1 不同水質的洗液對ELISA法檢測TP-Ab的OD值變化結果

表2 不同水質的洗液對ELISA法檢測TP-Ab的結果陽性率

表3 不同濃度的洗液ELISA法檢測TP-Ab的OD值變化結果

表4 不同濃度的洗液ELISA法檢測TP-Ab的結果陽性率

表5 不同洗液對ELISA法檢測梯度濃度TP-Ab質控結果(OD值)分析

3 討論

ELISA法操作簡單，靈敏度和特異性高，但影響因素也較多，如加樣量、洗板和溫度等等[5]。該方法為非均相免疫測定技術,需要洗去非特異性結合或過量的抗原抗體反應物,從而保證檢測結果的特異性[6],所以洗板也是其關鍵的一步，尤其是洗液的正確配制直接關系到洗板的質量。

TP-Ab ELISA法檢測一般采用雙抗原夾心法，原理是將抗原預先包被在固相載體表面，其后按不同的步驟分別加入待檢抗體和酶標抗原，充分反應后經適當的洗滌，使未與固相載體上包被的抗原結合的抗原抗體-酶標抗原復合物完全洗去，待加入相應的底物后通過酶對底物的催化顯色程度來對標本中的抗體進行定性或定量[2，7]。在整個試驗過程中，洗滌起了重要作用，如果洗滌不充分(次數不夠或洗滌不干凈)，殘留在微孔板上的酶標抗體中的酶會使后來加的無色底物液變成有色產物，產生了非特異性顯色反應，出現假陽性的結果[8，9]，并且洗滌次數越少越容易造成假陽性，尤其值得注意的是，試劑盒洗液的配制是由試劑廠家反復試驗驗證的，人為改變洗液配制的水質及比例容易影響洗滌效果，使一些非特異性結合物沒有洗掉而造成假陽性；也可能造成固相結合的抗原-抗體復合物脫離，使檢測吸光度值降低造成假陰性[7]。本實驗佐證了用自來水配制洗滌液比用蒸餾水配制的容易造成假陽性結果(P<0.05)，而純凈水與蒸餾水無明顯差異(P>0.05)。原因也許就是謝毅[10]認為的在一定范圍內洗液離子強度高低與非特異性反應的出現呈負相關而影響檢測結果。所以,洗液成分[4]改變會造成與固相結合的抗原／抗體脫離的程度不同，從而影響檢測的靈敏度，使樣本檢測的OD值改變[11]。本實驗中用蒸餾水配制不同濃度的洗液檢測結果是高濃度的洗液造成OD值偏低，陽性率降低；低濃度的洗液則使OD值升高，陽性率升高，也證實了上述觀點。也有部分實驗室用自來水配制洗液，更有甚者直接以自來水代替洗液，此種做法都很危險,應引起大家足夠的重視[12-15]。

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