江西惡性血液病患者殺傷細胞免疫球蛋白樣受體基因多態性研究

熊莉，孫瑜，李國良

(江西省血液中心，江西 南昌330052)

近年來，NK細胞在惡性血液病的發病和治療中的作用日益受到國內外學者的關注。目前認為，NK細胞的功能由其表面多種受體的綜合作用來實現，其中比較重要的一類受體是殺傷細胞免疫球蛋白樣受體 (killer cell immunoglobulin-like receptor,KIR)，KIR是主要表達于NK細胞和部分T細胞表面的免疫球蛋白樣超家族成員[1]。可通過特異性識別HLA-I類分子，介導調節NK細胞和部分效應T細胞的殺傷功能的激活或耐受。許多臨床資料顯示，某些特定的KIR-HLA錯配背景下的造血干細胞移植具有更好的移植物植入率及移植物抗白血病(graft-versus-leukemia，GVL)效應。 我們采用PCR-SSP檢測技術對62例惡性血液病患者進行KIR基因的檢測和分析，并與正常人群進行比較，以探討KIR基因的多態性與惡性血液病發生的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 病例組：南昌市三甲醫院臨床確診為惡性血液病的江西籍患者62例，男38例，女24例，年齡21~67(40.72)歲,其中急性髓系白血病(AML)15名,急性淋巴細胞白血病(ALL)16名,慢性髓系白血病 (CML)21例,骨髓增生異常綜合癥(MDS)4例,急性混合型白血病(AMLL)3例，淋巴瘤3例。對照組：葉倩等[2]研究的江西籍健康體檢者150例。

1.2 基因組DNA提取 取乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝靜脈血，DNA提取采用EZHighTM DNA Extraction Kit(吉盈科技公司)，操作方法依據試劑盒操作說明書進行。

1.3 KIR基因分型 運用序列特異性引物聚合酶鏈法，采用OIerup SSP KIR Genotyping試劑盒(北京博富瑞公司) 檢測 KIR2DLl、2DL2、2DL3、2DL4、2DL5、2DSl、2DS2、2DS3、2DS4、2DS5、3DLl、3D12、3DL3、3DSl、2DP1、3DP1， 具體操作按照說明書。Taq DNA聚合酶購自Promega公司，擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像儀觀察結果。

1.4統計學方法 KIR基因出現頻率(f)通過計數測得，KIR基因頻率 (GF)計算公式為：；病例組與正常對照組間差異顯著性用SPSS11.0統計軟件四格表χ2檢驗公式計算。最終結果以P值、優勢比(OR值)及95%可信區間(CI)列出。

2 結果

2.1 病例組與正常對照組KIR基因頻率比較 本實驗共檢測出16個KIR基因。62例患者個體中，3DL2出現頻率為100%。其他較常見的KIR基因分 別 為 2DL4、2DP1、2DS4、2DL1、2DL3、3DL1、3DL3、3DP1，頻率依次為 87.31%、82.03%、82.03%、78%、78%、61.89%、56.01%、54.21%；2DL5、2DS5、2DL2、2DS1、2DS2、2DS3、3DS1 分布頻率較低，頻率 依 次 為 18.68% 、15.76% 、15.76% 、14.81% 、9.30%、7.54%、6.67%。 對照組 3DL3、3DL2、2DL4出 現 在 所 有 個 體 中 ，2DL3、2DP1、3DL1、2DS4、2DL1基因比較常見，頻率依次為88.42%、78.39%、71.72%、66.33%、56.02%；2DL2、2DS3、2DS2、2DS5、2DS1、3DS1、2DL5比較少見，頻率依次為5.84%、7.98%、8.35%、13.20%、13.98%、14.75%、17.54% 。另外，病例組中2DL1、2DL2基因頻率高于對照組，差異具有統計學意義 (P<0.05)；病例組中2DL3、3DL3、3DS1、3DP1基因頻率低于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)，其他KIR基因位點頻率未發現統計學差異。見表1。

表1 惡性血液病患者與正常對照人群KIR基因頻率比較

2.2 惡性血液病患者KIR基因型分析 根據http://www.allelefrequencies.net網站上的KIR基因型命名，在62例患者個體中檢出32種基因型。“New?”表示查不到相應的GENOTYPE ID號，是新發現的基因型。 惡性血液病患者中最常見的單倍型為AA(1)，但在單倍型Bx中，最常見的為Bx(9)。AA型和Bx型分別為34例和28例，其中在Bx型中，AB型為26例，BB型為2例。A型單倍型與B型單倍型的比例為3.13:1。見表2。

3 討論

KIR基因定位于人類染色體19q13.4的白細胞受體基因群(leukocyte receptor complex，LRC)內，是繼HLA之后發現的人類又一具有高度多態性的免疫遺傳系統。已知的16個KIR基因包括：7個抑制性基因 (2DL1－3、2DL5、3DL1－3)、6 個活化性基因 (2DS1－5、3DS1)、1個同時具有活化和抑制功能的基因(2DL4)以及2個編碼無功能性 KIR受體的假基因(2DP1、3DP1)[3，4]。 NK 細胞毒性被認為由于KIR發揮著刺激性效應和抑制性效應之間平衡的結果[5，6]。有研究報道，機體對惡性血液病細胞的免疫殺傷和免疫逃逸與NK細胞功能的增強或缺失密切相關[7-9]。

KIR具有遺傳多樣性：一方面表現為同一KIR基因座位包含多個等位基因，另一方面由于同一個體的不同T、NK細胞克隆表達的KIR不同而表現為AA和Bx(包括AB及BB)等不同的單倍型。KIR基因高度多態性構成了不同個體和種族疾病易感性和免疫應答差異的遺傳學基礎。在對惡性血液病患者KIR基因多態性的研究中，學者們的研究結果不盡相同。Verheyden等[8]證實，比利時高加索人中白血病患者KIR2DL2和KIR2DS2的基因表達顯著增加。Zhang[10]等在研究了263例白血病患者的基因型后發現2DS1、2DS4基因頻率明顯升高。陳阿梅等[11]也報道北方地區白血病患者3DL1和2DL1比健康對照組顯著降低。

表2 惡性血液病患者KIR基因型分布

本研究結果顯示，惡性血液病患者的2DL1、2DL2基因頻率高于健康對照組，而2DL3、3DL3、3DS1、3DP1基因頻率低于健康對照組，差異均具有統計學意義。實驗結果與上述文獻報道不完全相同，分析原因如下：(1)本研究對象為惡性血液病患者。惡性血液病除了白血病，還包括淋巴瘤、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征等。另外，白血病分為多種類型，不同疾病的病理和臨床表現不同，說明它們的免疫發病機制也不同。多個KIR基因與惡性血液病相關聯，且不同類型的惡性血液病關聯的KIR基因也不完全相同，這表明了KIR與惡性血液病發病的相關性及復雜性。(2)病例組和正常對照組的標本量都較少，采用不同的對照組進行對比，可能會出現不同的實驗結果。僅僅是基因頻率水平的探討，要想揭示KIR基因在惡性血液病中如何作用是不夠全面的，需要擴大樣本做進一步研究。(3)研究國內外相關文獻，發現這些研究數據具有較大差異，結果不具有統一性，不能代表不同地區的實際情況。究竟是由于人種和地域差異所致，還是另有原因，還需進一步求證。

研究證實，對NK細胞活性的調節不是單個KIR基因作用的結果，而是抑制性受體基因和活化性受體基因共同作用的結果，因此，對個體KIR基因的研究應注重抑制性KIR和活化性KIR間的平衡以及最終表達于個體細胞表面的 KIR基因型。本實驗在惡性血液病患者中檢出32種基因型，單倍型AA、AB、BB分別為 34例、26例和 2例，A型單倍型與B型單倍型的比例為3.13:1。最常見的單倍型為 AA(1)，這與之前文獻報道相一致[12，13],說明KIR基因組合型以抑制性信號通路為主是一種常態，或許可以解釋NK細胞的自然殺傷效應受到KIR常態抑制作用，使自身細胞不會遭受自然殺傷。由于缺乏健康對照組的KIR基因型數據，本研究尚且無法比較惡性血液病患者的KIR基因型特點。此外，個體NK細胞的活性與KIR及其配體HLA-I類分子間的組合模式密切相關，因此探討KIR與HLA的相互作用及KIR對惡性血液病中不同疾病的影響是以后工作的研究方向。

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