外源性干擾物對血吸蟲間接血凝試驗結果的影響

蘭煒明 ，謝峰 ，黎曉琴 ，姜唯聲 ，謝曙英 ，葛軍 ，曾小軍

(1、江西省寄生蟲病防治研究所，江西 南昌330046；2、進賢縣血吸蟲病防治站，江西 進賢331700)

間接血凝試驗 (IHA，indirect hemagglutination assay)是血吸蟲病查病的主要方法[1,2]，現場工作中采集的血清樣本在處理過程中往往發生溶血，血吸蟲病病人由于個體差異或合并有其他并發癥，高膽紅素和高血酯(TG)血清的出現較常見。家兔血吸蟲病血清IHA試驗中溶血、反復凍融、肝素抗凝等因素的影響已有報道[3]，也有報道顯示在酶聯免疫試驗(ELISA)中，結合膽紅素、溶血血紅蛋白和乳糜在大于一定濃度下可能會影響ELISA結果，因此必須注意標本的前處理和標本的新鮮[4,5]。為了解人血清樣本出現溶血、血脂、膽紅素及抗凝劑是否對血吸蟲病IHA結果產生影響，本文探討這些物質在血吸蟲IHA檢測中的干擾作用，結果如下。

1 材料與方法

1.1 材料 血吸蟲病人(糞檢陽性人群)血清10份，正常人(來自非疫區，未接觸疫水人群)血清10份，膽紅素(分析純，MW584.67上海邁坤化工有限公司批號：20130410)，脂肪乳注射液(30%脂肪乳注射液西安力邦制藥有限公司 批號：1209044，甘油三酯的含量為28.55mmol/L)，IHA反應板(V型)，血吸蟲抗體檢測試劑盒 (IHA法)(江西環鄱科技發展有限公司 批號：20130509)，生理鹽水，蒸餾水。

1.1.1 溶血樣本制備 真空采血管采集8ml血吸蟲病人血清10份，小心吸取血清后，將剩下的血清與紅細胞置冰箱反復凍融2次，用希森美康XS-500i血細胞分析儀檢測每份溶血樣本血紅蛋白含量。再用每位患者血清稀釋溶血樣本，使每份血清樣本血紅蛋白含量分別為 4g/L、8g/L、16g/L、32g/L。

1.1.2 血漿樣本 對10名血吸蟲病人分別以臨床檢驗常規用檸檬酸鈉抗凝管(含3.8%檸檬酸鈉)、肝素鈉抗凝管(含肝素鈉45IU)和EDTA-K2抗凝管采集患者靜脈血5ml后分離血漿備用。

1.1.3 膽紅素血清樣本制備 準確稱取0.01g膽紅素 (注意避光)，加入到10ml蒸餾水中，配制成1710μmol/L膽紅素液。用蒸餾水稀釋膽紅素液配置濃度成1000μmol/L膽紅素標準液[6]。將10份血吸蟲病人及正常人血清分別混勻后加入適量膽紅素標準液，使膽紅素濃度為分別為10、50、100、150、200、250、300、350、400 和 450μmol/L， 在血吸蟲病人和正常人血清中加入與膽紅素標準液等量的生理鹽水作為膽紅素對照。

1.1.4 甘油三酯血清樣本制備 用蒸餾水稀釋醫用脂肪乳成含甘油三酯為20和28 mmol/L的標準液，分別在10份正常人血清和血吸蟲病人血清中加入適量甘油三酯標準液，使血清甘油三酯濃度分別為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0 和 16.0mmol/L， 在血吸蟲病人和正常人血清中加入與膽紅素標準液等量的生理鹽水作為甘油三酯對照。

1.2 方法 用血吸蟲抗體檢測試劑盒(IHA法)檢測采集的血清和血漿，操作按說明書進行，每份樣本測試終點滴度。

2 結果

2.1 溶血血清IHA結果 10份檢測樣本中，血紅蛋白濃度為4g/L、8g/L時，檢測結果不變。血紅蛋白濃度為16g/L時，有3份樣本抗體下降1個滴度，抗體幾何平均滴度(GMT)為1：40；血紅蛋白濃度為32g/L時，所有樣品抗體滴度較對照血清均下降，抗體平均幾何滴度為1：23。見表1。

2.2 含抗凝素血漿及對照血清的IHA結果 10份陽性血清和血漿進行IHA試驗，1份以EDTA-K2和1份以肝素鈉抗凝血漿抗體滴度與對照血清一致，其余血漿樣本效價較對照血清均下降1個滴度，對照血清GMT為1:49，枸緣酸三鈉、EDTA-K2、肝素鈉血漿GMT分別為1:25、1:26、1:26。見表2。

表1 溶血血清及對照血清IHA結果

表2 血清與血漿樣品IHA結果

2.3 含膽紅素血清及對照血清IHA結果 配制的含膽紅素陽性和陰性血清及對照血清進行IHA終點滴度試驗，顯示膽紅素濃度的高低變化均不會引起陽性血清IHA滴度的改變，也不會引起陰性血清的誤判。見表3。

表3 含高膽紅素血清及對照血清IHA結果

2.4 含甘油三酯血清及對照血清的IHA結果 配制的含甘油三酯陽性和陰性血清及對照血清進行IHA終點滴度試驗，顯示甘油三酯濃度在2.0~5.0 mmol/L時不會引起結果的變化，在6.0~10.0 mmol/L間影響陰性血清結果的判讀，在11.0 mmol/L以上陽性血清出現一個滴度的上升，同時影響陰性血清出現假陽性結果。見表4。

3 討論

血吸蟲病IHA試驗由于敏感性高、特異性強、操作簡便，是目前疫區現場用于血吸蟲病篩查的主要手段[7,8]，對血吸蟲病可疑病人采血進行IHA檢測血吸蟲抗體時，檢測樣本中常易出現如溶血、高膽紅素和(或)高血脂及抗凝血漿等情況。在臨床血吸蟲病診斷中對溶血無嚴格劃分標準[9,10]，而總膽紅素 1.71～17.1μmol/L(0.1mg/dl～1.0mg/dl)為正常范圍；血漿甘油三酯(TG)1.7～2.3mmol/L為臨界[11]，為獲得與臨床收集樣本基本相似的血清，本研究通過制備帶有單一干擾物質獲得模擬陽性和陰性血清進行IHA試驗，來驗證人工模擬狀態下外源性干擾物質是否對IHA結果產生影響及影響的程度，臨床血清樣本中外源性干擾物質的實際影響情況尚需進一步探討。

表4 含甘油三酯血清及對照血清的IHA結果

結果顯示，當溶血血清樣本血紅蛋白＜16g/L時對IHA的檢測無影響，血紅蛋白≥16g/L時，抗體效價隨血紅蛋白濃度升高而下降，與兔血清溶血樣本檢測結果相符[3]。不同抗凝劑血漿樣本中，除2份抗體效價不一致外，其他樣本結果均相同，但血清與血漿樣本IHA結果存在差異，陽性血漿樣本進行IHA檢測時，抗體雖均呈陽性，但相較于對照血清均下降1個滴度，且GMT較對照血清有所下降。結果表明對于血清抗體水平接近臨界值的樣本，以血漿為檢測樣本結果可能為假陰性，因此，在IHA檢測中不宜以血漿為檢測樣本。

血清中膽紅素的含量多少對IHA檢測結果亦無影響。血清甘油三酯濃度在2.0~5.0 mmol/L時對試驗亦無影響，但在6.0~10.0 mmol/L間影響陰性血清結果的判讀，在11.0 mmol/L以上陽性血清出現一個滴度的上升，陰性血清則出現假陽性結果，這與ELISA檢測結果報道相似[3]。血清甘油三酯濃度高于5.0 mmol/L時會影響IHA結果的準確性，在試驗中出現高血脂血清進行IHA檢測時，必要的預處理可能去除血脂對IHA結果的干擾[7]，或重新采血復查，以消除其對結果的影響。

綜上上述，在IHA試驗中,只有明確樣品中干擾因素對檢測結果的影響，排除影響因素，才能獲得準確的檢測結果。在本研究中模擬狀態下，顯示溶血、高血脂及抗凝樣本對IHA檢測結果均產生影響，血清膽紅素小于450μmol/L時對IHA結果無影響，因此在現場及臨床進行IHA檢測時應避免使用溶血和有抗凝劑的標本，高血脂標本需要復查結果。

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