江西省急性髓系白血病NPM1和FLT3-ITD基因突變分析

簡正偉 ，石淙 ，聞芳 ，萬臘根 ，張長林

(1、南昌大學第四附屬醫院檢驗科，江西 南昌330003；2、南昌大學第一附屬醫院檢驗科，江西 南昌330006)

急性髓細胞白血病 (acute myeloid leukemia,AML)是多能干細胞發生突變所形成的一類具有細胞和分子遺傳學特征的高度異質性疾病。隨著分子生物學技術不斷的應用于臨床，越來越多的基因突變檢測對臨床的治療起著重要提示作用。其中NPM1和FLT3-ITD基因是突變率最多見的兩類，2010年美國血液學會 (American Society of hematology)會議已明確[1]，NPM1基因突變是AML,尤其是正常核型AML預后良好的指標,而具有FLT3-ITD基因突變患者預后較差。本研究分析187例初發急性髓細胞白血病患者NPM1和FLT3-ITD基因突變情況，并分析其臨床特征。

1 材料與方法

1.1 臨床病例 收集2011年6月至2013年2月南昌大學第一附屬醫院急性髓細胞白血病初發病例187例，所有患者都經細胞形態學和流式細胞術免疫學分型，并參照《血液病診斷及療效標準》[2]確診為AML的病例。其中M1占9例，M2占72例，M3占50例，M4占20例，M5占24例，M6占4例。男女比例100:87，中位年齡41(13～79)歲。

1.2 染色體分析 取肝素抗凝的骨髓液2ml，換算成有核細胞約(1～2)×106／ml，然后分別用直接法和短期培養法制備染色體，采用G顯帶技術進行核型分析。染色體核型描述參照《人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN 2005)》。

1.3 NPM1和FLT3-ITD突變檢測 取200μlEDTA抗凝骨髓，參照飛捷生物科技公司的微量基因組DNA極速抽提試劑盒提取基因組DNA，獲得的基因組DNA通過紫外分光光度計進行定量，取50～100ng/μl基因組DNA進行基因突變檢測。NPM1突變檢測方法見參考文獻[3]。以特異性引物擴展FLT3-ITD基因突變區,上游引物為5’gcaatttaggtatgaaagccagc-3’， 下游引物為 5’ctttcagattttgacggcaacc-3’,擴展產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，野生型FLT3擴展產物為329bp，存在ITD突變會在野生型條帶上游出現特異性條帶。

1.4 統計學分析 應用SPSS17.0統計學軟件進行分析，以中位數進行統計，P<0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 NPM1和FLT-ITD突變檢測 采用等位基因特異性PCR(Allele-specific PCR,AS-PCR)方法檢測NPM1基因突變，該方法可以檢測到4種常見的NPM1基因突變(圖1)。采用PCR擴展FLT3基因第12外顯子，通過觀察PCR產物在瓊脂糖凝膠電泳的遷移情況判斷FLT3-ITD突變(圖2)。在收集到的187初發急性髓系白血病患者中，共檢查到67例(35.83%)患者存在基因突變，其中39例(20.68%)AML患者存在單一 NPM1突變，15例(8.02%)出現單一FLT3-ITD突變，13例(6.95%)患者同時存在NPM1和FLT3-ITD突變。

圖1白血病病人NPM1突變檢測

圖2 FLT3-ITD突變檢測

2.2 NPM1和FLT-ITD突變與FAB分型關系 見表1。

表1 白血病病人基因突變情況n(%)

2.3 臨床資料特征 在187例患者中，有NPM1突變患者和非NPM1突變患者之間在男女比例、中位年齡、血小板中位數和骨髓原始細胞比例中位數均沒有差異性，但是白細胞中位數二者有差異(表2)。在FLT3-ITD突變患者臨床特征分析中，在男女比例、中位年齡、血小板中位數和非FLT3-ITD突變患者沒有差異性，兩者在白細胞中位數和骨髓原始細胞比例中位數有差異性，FLT3-ITD突變患者白細胞中位數和骨髓原始細胞比例中位數都比非FLT3-ITD突變患者高(表3)。

表2 NPM1突變患者臨床特征分析

表3 FLT3-ITD突變患者臨床特征分析

2.4 突變和細胞遺傳學的關系 在187例白血病患者中，有72例患者沒有檢測染色體或者檢測了未檢見分裂相，在可分析的115例患者中，80例正常核型當中，有17例(21.3%)NPM1突變;在35例異常核型組中，檢見13例NPM1突變；在正常核型中同時檢測出11例FLT3-ITD突變，突變率為13.8%，而在異常核型組中，檢出8例FLT3-ITD突變，突變率為22.9%，但兩者之間均無統計學意義(表 4)。

表4 比較白血病病人NPM1和FLT3-ITD突變患者染色體情況

2.5突變型和野生型療效的比較 187例患者治療效果比較，其中NPM1突變型52例，野生型135例，2組之間≤2個治療周期CR緩解率分別為79.5%和35.8%(P<0.05);FLT3-ITD突變患者28例，野生型159例，兩者之間≤2個治療周期CR緩解率分別為27.6%和72.8%(P<0.05);隨訪時間1~25.6月，中位隨訪周期9.6月。

此外，我們把187例患者分成NPM1+/FLT3-ITD-組、NPM1-/FLT3-ITD-組、NPM1+/FLT3-ITD+組和NPM1-/FLT3-ITD+組進行療效觀察，2個治療周期CR緩解率分別為82.3%、65.8%、52.9%和26.8%。其中單獨NPM1突變組完全緩解率最高，而單獨FLT3-ITD突變組完全緩解率最低。

3 討論

急性髓系白血病AML是起源于造血干細胞的惡性克隆性疾病，具有高度的異質性。一直以來，我們都是通過檢測白血病患者染色體的變異來區分病人的預后情況。但是對于一些染色體正常核型病人，我們不能很好地區分患者的預后情況。隨著分子生物學技術不斷地應用于臨床，一些新型基因突變檢測可以很好地對病人治療、預后提供指導價值。在這些基因突變中，NPM1和FLT3-ITD是突變率最高，對預后評估最有價值的兩類基因。

我們在187例初發白血病患者中分別檢測出NPM1突變率為27.80%(52/187)；檢測出FLT3-ITD突變率為14.97%(28/187)。 和日本學者Suzuki T(24.9%NPM1,22.6%FLT3-ITD)[4]；德國學者 Thiede C(27.5%NPM1,21%FLT3-ITD)[5]、泰國學者 Boonthimat C (26%NPM1,33%FLT3-ITD)[6]相比較，NPM1突變率基本接近，但是他們FLT3-ITD突變率都比我們的研究結果要高，可能是由于樣本分布不同和種族差異有關。

在本研究中NPM1突變主要存在于M5、M2和M1中。丁子軒等[7]研究656例中國急性髓系白血病患者NPM1基因突變情況，其中有169例突變，突變率大約25.8%，其中以M5、M1多見。Jeon Y等[8]研究發現，在83例AML患者中有NPM1突變19例，突變率為22.9%，在形態學亞型中多見于M5和M2。這和我們的研究結果相近。但是我們研究FLT3-ITD突變多存在于M1、M4中較多見，而國外學者研究病例中FLT3-ITD突變多存在于M3[9]，這可能是病例樣本組成不同或者國內外樣本差異有關。

我們研究FLT3-ITD突變患者在年齡 、性別和血小板中位數之間差異沒有統計學意義，但是突變陽性患者比陰性患者在白細胞中位數和骨髓原始細胞比例中位數均顯著偏高，這和國外研究結果相一致[10]。這可能與FLT3-ITD突變引起近膜區空間構型改變引起RTK持續激活,導致細胞增殖有關[11]。而NPM1突變患者在年齡 、性別、血小板中位數和骨髓原始細胞比例中位數同陰性患者之間無顯劇差異，但是突變陽性患者白細胞中位數較陰性患者偏高[12]。

國內外研究認為NPM1和FLT3-ITD突變在染色體正常核型多見[13]，但我們在187病例中只有115例可分析染色體核型，兩者突變在正常核型和異常核型之間并沒有差異性，這與國外研究結果不一致，可能是國內外病例組成不同；另外我們有72例患者沒有檢測出染色體，可能這部分病例有較多正常核型樣本，所以對正異常核型比有一定影響。

一般研究認為NPM1基因突變是預后良好的指標，存在NPM1基因突變的患者緩解率高，生存期長，并且在疾病進展中比較穩定[14，15]。而FLT3-ITD突變意義則相反，一般預后較差。2008年世界衛生組織(World Health Organization，WHO)和歐洲造血與血液病理學協會共同制定AML新的分型分類計劃，認為NPM1基因突變的可以作為AML亞群中獨立的預后指標[16]。我們把NPM1和FLT3-ITD突變陽性和陰性患者在2個治療周期CR緩解率進行比較，發現NPM1陽性患者在2個治療周期CR緩解率較陰性患者效果好，而FLT3-ITD突變陽性患者則CR緩解率效果差，兩者之間差異均有統計學意義。同時我們按NPM1和FLT3-ITD突變陰陽性分成四組，發現單獨NPM1突變組完全緩解率最高，而單獨FLT3-ITD突變組完全緩解率最低，這與國內外研究結果相符[17]。

通過同時檢測NPM1和FLT3-ITD突變情況，可以給臨床白血病患者治療、預后提供指導意義。

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