生物合成量子點在化學生物學實驗教學中的應用

崔 然

(武漢大學 化學與分子科學學院, 生物醫(yī)學分析化學教育部重點實驗室, 湖北 武漢 430072)

生物合成量子點在化學生物學實驗教學中的應用

崔 然

(武漢大學 化學與分子科學學院, 生物醫(yī)學分析化學教育部重點實驗室, 湖北 武漢 430072)

如何通過生物體系來解決化學難題是化學生物學的新領域之一。活細胞合成CdSe量子點是利用活酵母細胞作為反應器,通過調控細胞的生長周期來耦合細胞內不相關的兩條生化反應途徑,使其在活酵母細胞內發(fā)生反應,通過將傳統(tǒng)的CdSe量子點合成方法中涉及到的繁瑣危險的化學操作演變?yōu)閮H僅‘喂養(yǎng)’細胞,即可獲得閃閃發(fā)光的CdSe量子點。該方法成功地建立了一個通過生物體系來解決化學難題的范例,并且實驗方法溫和安全,實驗結果具有展示性,適合于課堂教學。

活酵母細胞; 化學生物學; 量子點

化學生物學是現(xiàn)代化學與生物化學在深層面交叉的學科,誕生于上世紀九十年代。世界上一些著名的大學如美國哈佛大學和康奈爾大學等都設立了化學生物學系,著名的美國Scripps研究所也于二十世紀九十年代中葉成立了化學生物學研究所。國內一些大學和研究機構也分別設立了化學生物學研究中心、重點實驗室、化學生物學系和化學生物學專業(yè)[1],武漢大學也是較早設立化學生物學專業(yè)的學校之一。但是到目前為止,化學生物學仍然是一個新的、定義不太明確的領域[2-3]。

對于化學生物學這樣一門新興專業(yè)的課程教學,尤其是其相應的實驗課程的教學,不像其他學科的實驗教學有成熟的體系。另外,生命系統(tǒng)的復雜性決定了生命本質的研究是一個極其漫長的過程,這就決定了化學生物學這門學科是一個不斷推陳出新的前沿性的學科。并且化學以及生物學都是以實驗為基礎的學科,如何通過實驗教學向學生展示前沿的化學生物學的研究進展成為了一個緊迫而艱巨的任務。

量子點(quantum dot,即半徑小于或接近激子玻爾半徑的半導體納米晶粒)[4]作為一類性能優(yōu)良的熒光標記納米材料,在生物醫(yī)學領域應用的突出優(yōu)勢和巨大潛力[4-7],已經得到國際上的高度認可。活細胞合成量子點是納米材料的研究領域中具有我國原創(chuàng)性的研究。通過對活酵母細胞的培養(yǎng)條件的控制,就可以在顯微鏡下直觀地看到細胞自身合成的閃閃發(fā)光的量子點[8]。該研究將繁瑣危險的化學操作演變?yōu)閮H僅培養(yǎng)細胞,既可以培養(yǎng)學生在生物實驗方面的動手能力,又可以向學生展示出化學領域在納米材料方面的最新進展,因此非常適合作為學生實驗。目前,我們在已有的研究工作的基礎上,已經將部分研究成果簡化為一個簡便、易行的化學生物學本科教學實驗,并收到了良好的效果。

1 活酵母細胞合成量子點的實驗原理

傳統(tǒng)的CdSe量子點的合成通常采用金屬化合物/元素有機物路線,其合成通常都采用易燃易爆有毒的有機試劑,并且需要在無水無氧的300 ℃的高溫下進行[7-10],合成需要的條件苛刻,操作方法難以控制。這種傳統(tǒng)的化學合成方法無論對環(huán)境還是操作者都有很大的潛在的危險。

本文嘗試通過生物與化學的交叉來解決化學領域內這些棘手的問題。眾所周知,在生物體內存在著各種高效、專一、溫和的酶促生化反應,雖然發(fā)生在活細胞中的這些生化反應十分復雜,但是其指導原理在所有生物中都是相通的。如果能夠針對生化反應的特點有目的地對其加以調節(jié)和控制,甚至對多個不同反應途徑進行調控,就能夠將這些高效的生化反應體系引入到化學合成領域中,實現(xiàn)我們所期望的、原本不可能發(fā)生的反應。

酵母細胞是具有清楚研究背景的模式生物[11-12],是合成熒光納米材料CdSe量子點的理想的候選生物。釀酒酵母(eukaryoticSaccharomycescerevisiae)是一個非常精密的微小的真核細胞,在其體內有成千上萬個生化反應精確地調控著細胞自身的各種代謝過程[13-14]。它可以通過自身錯綜復雜的調控體系對環(huán)境中各種各樣的變化產生快速精準的反應13。因此這樣的一種生物體不僅僅是基礎科研的一個良好的平臺,更是生物工程和生命科學當中的一個有力的工具[12,14]。

正是由于酵母細胞內這些精密的生化反應,使得其在特定的條件下,可以分別通過對Na2SeO3的代謝產生帶有—SeH基團的有機硒[15]以及對CdCl2的解毒形成穩(wěn)定的[Cd·(GS)2]2+[16],得到的這些物質恰好是合成CdSe量子點的原料。但是這兩條代謝途徑在正常的酵母細胞內是互不相關的,只有通過控制酵母細胞的培養(yǎng)時間,使酵母細胞在發(fā)生Se代謝的同時發(fā)生CdCl2的解毒,從而在酵母細胞內同時產生合成CdSe量子點的原料,隨后通過控制酵母細胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時間,最終成功地在30 ℃下細胞內合成出來多種熒光顏色的CdSe量子點,避免了高溫(300 ℃)或高壓，以及所有易燃、易爆、有毒的有機試劑。活酵母細胞合成CdSe量子點原理示意見圖1。

圖1 活酵母細胞合成CdSe量子點原理示意圖

2 活酵母細胞合成CdSe量子點技術在化學生物學實驗教學中的應用

活酵母細胞合成CdSe量子點技術在化學生物學實驗教學的應用,具體來說需要從以下幾個方面進行。

(1) 實驗目的：①了解酵母細胞合成CdSe量子點的原理；②掌握酵母細胞的培養(yǎng)；③掌握酵母細胞合成CdSe量子點技術；(4)學習酵母細胞合成CdSe量子點的表征。

(2) 實驗藥品及儀器：蛋白胨、葡萄糖、酵母提取物、水、0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液、0.1 mol/L的Na2SeO3溶液、0.1 mol/LCdCl2溶液、超純水；無菌操作臺、高壓蒸汽滅菌鍋、分析天平、超聲儀、無菌操作箱、搖床、離心機、倒置熒光顯微鏡。

3 實驗步驟

(1) YPD培養(yǎng)基的配制。在無菌操作臺(見圖2)中進行以下操作：先在燒杯中放入一半水量,然后按配方比例分別準確稱取葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物(葡萄糖20 g,蛋白胨20 g,酵母提取物10 g,水1000 mL),依次放入燒杯中,用玻璃棒攪拌使溶化后,補充水分到所需的總體積；隨后用0.1 mol/L氫氧化鈉調節(jié)培養(yǎng)基的pH,直至pH值在7.2～7.6之間；將配好的培養(yǎng)基分裝到錐形瓶中,錐形瓶中液體培養(yǎng)基體積應為1/5左右。錐形瓶口用專用封口膜封口,防止污染,同時保證有良好的通氣性能。三角燒瓶的封口膜外包一層牛皮紙,以防止滅菌時冷凝水潤濕封口膜。注明培養(yǎng)基名稱、配制日期等。培養(yǎng)基分裝好后立即用高壓蒸氣滅菌(0.56 kg/cm2,112.6 ℃,30 min),以防止雜菌生長。

圖2 無菌操作臺

(2) 活酵母細胞合成CdSe量子點。

① 酵母細胞培養(yǎng)至生長曲線的穩(wěn)定期。在無菌操作臺內的酒精燈附近,左手托住已培養(yǎng)出單菌落的酵母平板,用拇指和食指將平板打開一定角度,用無菌竹簽從中挑取一個單菌落,放入20 mL的YPD培養(yǎng)基中,輕輕混勻,注意避免竹簽碰在燒瓶瓶口,封上封口膜,蓋好平板；將加有酵母單菌落的20 mL的YPD培養(yǎng)基放入搖床中,在30 ℃、170 r/min培養(yǎng)24 h至酵母細胞生長穩(wěn)定期。

② 酵母細胞的硒化培養(yǎng)。在無菌操作臺中將生長至穩(wěn)定期的酵母細胞用移液槍吸取1%(200 μL)移至20 mL新鮮的YPD培養(yǎng)基中,共取4份,封上封口膜,做好標記；將此新鮮的YPD培養(yǎng)基放入搖床中,在30 ℃、170 r/min培養(yǎng)24 h； 向其中2份分別加入0.1 mol/L的Na2SeO3溶液(終濃度為5 mmol/L),封上封口膜,放入搖床中,在30 ℃、170 r/min培養(yǎng)24 h,分別標記為1號和2號。另外2份不加0.1 mol/L的Na2SeO3溶液,繼續(xù)放在搖床中,分別標記為3號和4號。將此4管放入搖床,在30 ℃、170 r/min培養(yǎng)24 h。

③ 酵母細胞合成CdSe量子點。將步驟②中4份酵母細胞分別轉入無菌離心管中,在轉速為2 000r/min的離心機中離心5 min,取出,傾去上清液后,將收集離心得到的酵母分別轉入4份20 mL新鮮的YPD培養(yǎng)基中,標記為對應的記號；在1號和3號新鮮的YPD培養(yǎng)基中加入0.1 mol/L的CdCl2溶液(終濃度為1 mmol/L),2號和4號不加CdCl2溶液,封上封口膜；放入搖床中,在30℃、170 r/min培養(yǎng)24 h。1號為樣品,2號—4號為對照。

(3) 酵母細胞合成的CdSe量子點的表征。將培養(yǎng)的4管細胞在轉速為2000 r/min的離心機中離心5 min,取出,傾去上層培養(yǎng)基；取3 mL、pH為8.0的Tris-HCl緩沖液加入離心管中,重懸后,在同樣條件下離心洗滌,重復3次；將洗干凈的酵母用3 mL、pH為8.0的Tris-HCl緩沖液重懸；從樣品中取5 μL細胞懸浮液滴于載玻片上,蓋上蓋玻片制樣；在倒置熒光顯微鏡下用100×油鏡進行觀察，將倒置熒光顯微鏡的汞燈強度調到最強,并將物鏡下的光圈調至UV,觀察酵母細胞的熒光(見圖3)。比較合成了CdSe量子點的酵母細胞與對照酵母細胞的熒光區(qū)別。

圖3 合成CdSe量子點后酵母細胞的熒光顯微鏡圖片

4 教學建議

(1) 本實驗需要的時間周期為4 d,因此需要給學生較長的時間來學習。建議將本實驗作為學生的設計實驗。

(2) 在進行本實驗前,要求學生查閱《微生物學實驗》,學習微生物培養(yǎng)的基本操作和知識。

(3) 實驗完成后進行課堂討論與總結,集體討論以下2個問題:①為什么最終得到樣品中的酵母細胞與對照的酵母細胞的熒光有區(qū)別,其區(qū)別說明了什么？②酵母細胞為什么要培養(yǎng)至生長曲線的穩(wěn)定期？指導教師可借此機會向學生介紹微生物生長的特性以及CdSe熒光量子點的特性。

5 結束語

實踐表明,活酵母細胞合成CdSe量子點實驗具有生動、效果直觀、便于操作等優(yōu)點,既有利于學生理解和掌握微生物生長的特性等生物學方面的知識,也有利于學生掌握熒光納米材料的特性等化學方面的前沿動態(tài),同時也有利于激發(fā)學生的學習積極性以及創(chuàng)新精神。

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Application of quantum dots biosynthesis technology in teaching of chemical biology experiments

Cui Ran

(Key Laboratory of Analytical Chemistry for Biology and Medicine(Ministry of Education),College of Chemistry and Molecular Sciences, Wuhan University,Wuhan 430072, China)

Utilizing biosystems to solve the problems of chemistry is one of the new courses in chemical biology.By contriving to couple unrelated intracellular biochemical reactions in an appropriate space and time sequence,the controllable biosythesis of fluorescent CdSe QDs at mild condition has been realized just by incubating yeast cells at 30°C.This strategy is a good example of how the biological systems can address some of the problems associated with traditional methods of chemical synthesis.This controllable and mild strategy is suitable for the chemical biology teaching.

living yeast cells; chemical biology; quantum dots

2014- 12- 08

國家自然科學基金青年科學基金項目“以活細胞為平臺可控制備生物檢測標記納米材料”(21105075);中國博士后科學基金特別資助項目“調控生化反應制備面向活體成像的近紅外納米生物探針”(2012T50663)

崔然(1981—),女,河南焦作,博士,講師,研究方向為納米生物醫(yī)學分析.

E-mail：cuiran@whu.edu.cn

Q-33

B

1002-4956(2015)7- 0071- 04