奧扎格雷鈉對(duì)肢體缺血再灌注骨骼肌的影響

孟壯志 趙雪紅 李迪 楊 林 李建國(guó)

奧扎格雷鈉對(duì)肢體缺血再灌注骨骼肌的影響

孟壯志 趙雪紅 李迪 楊 林 李建國(guó)

目的 探討奧扎格雷鈉對(duì)肢體缺血再灌注骨骼肌的保護(hù)作用。方法 健康成年家兔20只,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組, 每組10只。建立兔肢體缺血再灌注損傷動(dòng)物模型。在即將恢復(fù)血流灌注時(shí),對(duì)照組自耳緣靜脈注射生理鹽水, 實(shí)驗(yàn)組奧扎格雷鈉注射液。分別在缺血前、缺血后2 h、再灌注后1 h、再灌注后3 h采集術(shù)側(cè)股靜脈血樣。測(cè)定血清乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)的含量。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組再灌注后LDH、CK明顯低于對(duì)照組(P＜0.01), 骨骼肌組織濕/干重比值低于同期對(duì)照組(P＜0.05)。光鏡及電鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組骨骼機(jī)損傷輕于對(duì)照組。結(jié)論 奧扎格雷鈉能夠緩解組織水腫, 保護(hù)缺血再灌注骨骼機(jī)。

奧扎格雷鈉；骨骼肌；再灌注損傷

臨床護(hù)理中止血帶應(yīng)用時(shí)間過長(zhǎng)、血管損傷、骨折和骨骼肌的擠壓傷都不可避免的會(huì)引起骨骼肌的缺血再灌注損傷。骨骼肌的缺血再灌注損傷輕者會(huì)影響患肢骨骼肌的收縮功能, 重者可致肢體功能喪失、截肢甚至導(dǎo)致患者死亡［1,2］。奧扎格雷鈉是一種特異性血栓A2(TXA2)合成酶抑制劑, 能降低TXA2, 促進(jìn)前列環(huán)素I2(PGI2)的生成, 并維持二者間的平衡, 還能選擇性地?cái)U(kuò)張血管, 改善微循環(huán)和能量代謝, 抗血小板聚集［3-5］。奧扎格雷鈉目前已廣泛用于治療缺血性心腦血管病, 但至今有關(guān)奧扎格雷鈉對(duì)骨骼肌缺血再灌注損傷的防治作用的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。因此, 本研究擬用家兔肢體缺血再灌注損傷模型, 觀察奧扎格雷鈉對(duì)肢體缺血再灌注骨骼肌損傷的防護(hù)作用。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)選用健康雄性大耳白兔20只, 體重2.5～3.0 kg (由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供), 隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組, 每組10只。

采用改良的孫瑞芝等［6］的方法建立家兔骨骼肌缺血再灌注損傷動(dòng)物模型。術(shù)前12 h禁食, 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射(1 ml/kg), 麻醉后固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)。在左后肢股三角處沿股血管走行切開皮膚, 暴露股血管鞘, 游離股動(dòng)脈、靜脈及神經(jīng), 于腹股溝韌帶處用微血管夾夾閉股動(dòng)脈, 在阻斷處以下用張力帶環(huán)扎后肢以阻斷側(cè)枝循環(huán)。缺血2 h后取下橡皮帶和血管夾, 恢復(fù)肢體血供。實(shí)驗(yàn)組于再灌注開始即刻從耳緣靜脈注射奧扎格雷鈉注射液(2 mg/kg), 對(duì)照組從耳緣靜脈注射等容生理鹽水。

1.2 檢測(cè)項(xiàng)目及方法

1.2.1 血清LDH、CK的測(cè)定 每組動(dòng)物分別于缺血前、缺血后2 h、再灌注后1 h和再灌注后3 h, 從左側(cè)股靜脈取血樣2 ml, 離心、全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)貝克曼CX-4型)測(cè)定血清中LDH、CK的含量(U/L)［7］。

1.2.2 骨骼肌組織濕/干重比值的測(cè)定 分別于上述各時(shí)間點(diǎn), 取左側(cè)小塊脛前肌, 迅速稱其濕重, 放置60℃恒溫箱60 h, 稱其干重, 計(jì)算 濕/干重比值。

1.2.3 形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 ①石蠟切片制備及光鏡觀察：每組任選2只動(dòng)物, 分離脛前肌, 切成2 cm×1 cm×0.5 cm大小的組織塊, 置于包埋盒, 然后置于4%多聚甲醛液中固定6 h以上。常規(guī)乙醇梯度脫水、透明, 石蠟包埋, 切片, HE染色,顯微鏡下觀察, 拍照。②電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)：將上述經(jīng)多聚甲醛固定的脛前肌切成1 mm3大小的組織塊, 置于3%戊二醛固定液中, 4℃過夜。0.1 M 磷酸緩沖液浸洗, 1%鋨酸4℃后固定, 常規(guī)乙醇梯度脫水；Epon812包埋劑浸透、包埋、聚合；超薄切片(LKB-NOVA超薄切片機(jī)), 透射電鏡下觀察并攝片(H-7500型透射電鏡)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x-±s)表示, 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清中LDH、CK變化

2.1.1 血清LDH變化 與缺血2 h相比, 再灌注1 h后LDH即明顯增高(P＜0.01)；再灌注即刻注射奧扎格雷鈉, LDH增高的程度明顯降低(P＜0.01)。見表1。

2.1.2 血清CK變化 再灌注1 h后LDH與缺血2 h相比明顯增高(P＜0.01)；實(shí)驗(yàn)組, CK明顯低于同期對(duì)照組(1 h P＜0.05,3 h P＜0.01)。見表2。

2.2 骨骼肌組織濕/干重比值 在缺血前和缺血2 h后, 脛前肌濕/干重比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；再灌注1 h、3 h后骨骼肌組織濕/干重比值較同組缺血后2 h明顯升高(P＜0.05)；與對(duì)照組相比, 實(shí)驗(yàn)組的濕/干重比值明顯降低(P＜0.05)。見表2。

表1 兩組血清LDH值比較( x-±s)

表2 兩組血清CK值比較( x-±s)

表3 奧扎格雷鈉對(duì)缺血再灌注后脛前肌濕/干重比值的影響( x-±s)

2.3 結(jié)構(gòu)的變化

2.3.1 光鏡觀察 缺血2 h后, 光鏡下可見骨骼肌纖維輕度腫脹, 橫紋可見, 肌核存在。對(duì)照組, 再灌注1 h后, 肌纖維出現(xiàn)明顯水腫, 橫紋消失；再灌注3 h后, 部分區(qū)域肌核消失見圖1。實(shí)驗(yàn)組, 再灌注1 h和再灌注3 h后, 僅部分肌纖維輕度腫脹, 肌核接近正常, 見圖2。

2.3.2 透射電鏡觀察 對(duì)照組再灌注3 h后, 肌原纖維排列紊亂, 線粒體出現(xiàn)空泡樣變、嵴斷裂、糖原顆粒減少, 肌漿網(wǎng)擴(kuò)張雙側(cè)終池電子密度增高, 見圖3。實(shí)驗(yàn)組, 再灌注3 h后, 肌原纖維排列整齊, 三聯(lián)體、糖原顆粒較對(duì)照組增多,三聯(lián)體基本完整, 見圖4。

圖1 對(duì)照組再灌注后3 h骨骼肌(HE×400)

圖2 實(shí)驗(yàn)組再灌注后3 h骨骼肌(HE×400)

圖3 對(duì)照組再灌注后3 h骨骼肌 (×30000)

3 討論

骨骼肌是人體含量最多的組織, 其對(duì)缺血損傷異常敏感。正常骨骼肌細(xì)胞內(nèi)含有豐富的LDH、CK等酶類, 缺血、缺氧等損傷可致細(xì)胞膜通透性增高, 細(xì)胞內(nèi)所含的酶即釋放入血, 其含量的高低可反映細(xì)胞損傷的程度。因而血清中此類酶的含量通常作為反映肌細(xì)胞損傷的敏感指標(biāo)。

本研究結(jié)果表明, 缺血再灌注1 h后血清LDH和CK即明顯升高, 表明再灌注引起骨骼肌細(xì)胞膜的通透性增加, 這與以往的大量研究結(jié)果相一致。形態(tài)學(xué)結(jié)果也證實(shí), 再灌注組后骨骼肌組織細(xì)胞損傷非常明顯。靜脈注射奧扎格雷鈉后再灌注, 可抑制再灌注后骨骼肌纖維LDH、CK的釋放；同時(shí),形態(tài)學(xué)結(jié)果表明, 奧扎格雷鈉注射組肌細(xì)胞損傷程度較同期對(duì)照組明顯減輕, 幾乎近于正常。

綜上所述, 奧扎格雷鈉能夠保護(hù)缺血再灌注損傷引起的LDH和CK的釋放, 保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整。但奧扎格雷鈉發(fā)揮作用的具體機(jī)制還不清楚, 有待于進(jìn)一步的研究。

圖4 實(shí)驗(yàn)組再灌注后3 h骨骼肌(×30000)

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10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.05.201

2014-10-22］

國(guó)家自然科學(xué)基金(項(xiàng)目編號(hào)：No.31300981)；湖北省自然科學(xué)基金(項(xiàng)目編號(hào)：2012FFC05601)

1028041 內(nèi)蒙古民族大學(xué)人體解剖學(xué)系(孟壯志 李迪)；湖北文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院(趙雪紅 楊林)通訊作者：孟壯志 趙雪紅