復方熊膽茵陳顆粒微生物限度檢查及控制菌檢查方法驗證*

吳 仲，張 勛，孔祥佳，徐 偉，洪振豐

(福建中醫藥大學，福建 福州 350122)

復方熊膽茵陳顆粒微生物限度檢查及控制菌檢查方法驗證*

吳 仲，張 勛，孔祥佳，徐 偉，洪振豐△

(福建中醫藥大學，福建 福州 350122)

目的 建立復方熊膽茵陳顆粒的微生物限度檢查方法，保證檢驗結果的準確可靠。方法 按中國藥典方法進行菌回收率試驗及控制菌檢查方法驗證。結果 5種試驗回收率試驗均為70%以上，其中細菌以培養基稀釋法進行檢查，酵母菌、霉菌以常規法即可。控制菌檢查中，大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌3者試驗組均可檢出試驗菌，陰性組均無菌生長，陰性菌對照組亦無菌生長。結論 本試驗建立的方法可作為復方熊膽茵陳顆粒的微生物限度檢查方法學驗證的依據。

復方熊膽茵陳顆粒；微生物限度；控制菌檢查

復方熊膽茵陳顆粒是本校阮時寶教授的驗方，由熊膽粉、茵陳、山楂等 7 味中藥組成，具有清肝利濕、化痰祛瘀的功效，用于肝膽濕熱、痰濁血瘀型脂肪肝，目前已開發為院內制劑[1]。為控制復方熊膽茵陳顆粒的質量，我們對本品的質量標準進行了研究，根據2010版《中華人民共和國藥典》的相關規定[2]，為有效反映本品的污染情況，建立復方熊膽茵陳顆粒的微生物限度檢查方法并對其進行驗證，以期建立適合該制劑的微生物限度檢查方法，為制劑進一步開發提供依據。

1 材料

1.1 儀器 超凈工作臺、電熱恒溫培養箱(HH-B11-500型、30-35℃)、生化培養箱(SPX-150型25-28℃)、勻漿器(300-8000r/min)、電熱恒溫水浴鍋(HH-8型)、立式壓力蒸汽滅菌鍋(LDZX-75KBS型)、電子天平(SE602F型)。

1.2 試液

1.2.1 稀釋劑與培養基 pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、0.9%無菌氯化鈉溶液，均由中檢所提供。營養瓊脂培養基、改良馬丁培養基、改良馬丁瓊脂培養基、營養肉湯培養基、乳糖膽鹽發酵培養基購自廣東環凱微生物科技有限公司，玫瑰紅鈉瓊脂培養基、膽鹽乳糖培養基(BL)、4—甲基傘形酮葡糖苷酸培養基(MUG)、四硫磺酸鈉亮綠培養基(TTB)、膽鹽硫乳瓊脂培養基(DHL)、曙紅亞甲藍瓊脂培養基(EMB)購自北京陸橋技術有限公司。上述培養基配方與中國藥典2010版配方均相同。

1.2.2 供試藥 復方熊膽茵陳顆粒(由福建中醫藥大學生產，批號20120901、20121012、20121203)。

1.2.3 試驗菌株 大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44 102]、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26 003]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63 501]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98 001]、黑曲霉菌(Aspergillus niger)[CMCC(F)98 003]、乙型副傷寒沙門菌(Salmonella paratyphi B)[CMCC(B)50 094]等均由福建省藥品檢驗所提供。

2 方法

2.1 菌液的制備

2.1.1 細菌、霉菌及酵母菌計數用菌液的制備 取經30～35℃培養18～24 h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的營養肉湯培養物1ml至9 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液中，梯度稀釋，使之含菌數約為50～100 cfu/mL的菌懸液，作為試驗菌計數備用。

經23～28℃培養24～48 h的白色念珠菌的改良馬丁培養物1 mL至9 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液中，梯度稀釋至使之含菌數約為50～100 cfu/mL的菌懸液，作為試驗菌計數備用。

經23～28℃培養5～7 d的黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面培養物，加入3～5 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液(含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80)洗脫孢子，并將孢子懸液吸出轉入無菌試管內[3]，以0.9%無菌氯化鈉溶液梯度稀釋至使之含孢子數約為50～100 cfu/mL的孢子懸液，作為試驗菌計數備用。

2.1.2 控制菌檢查方法驗證用菌液的制備 接種新鮮培養的大腸埃希菌至營養肉湯培養基，于30～35℃培養18～24 h。取上述營養肉湯培養物梯度稀釋，制成每1 mL含菌數為10～100 cfu的菌懸液，備用。

接種乙型副傷寒沙門菌至營養肉湯培養基中，于30～35℃培養18～24 h。取上述營養肉湯培養物梯度稀釋，制成每1 mL含菌數為10～100 cfu的菌懸液，備用。

2.2 供試液的制備 取供試品10 g，流加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，充分搖勻，作為1∶10供試液備用。

3 回收率的測定

3.1 常規法測定

3.1.1 試驗組 取供試液、試驗菌液1ml分別注入平皿內，并傾入15～20 mL瓊脂培養基，搖勻，平行重復2次，按平皿法計數。

3.1.2 菌液組 測定所加的試驗菌數，取試驗菌注入平皿內，并傾入15～20 mL瓊脂培養基，搖勻，平行重復2次，按平皿法計數。

3.1.3 供試品對照組 取供試液1 mL注入平皿內，分別傾入15～20 mL瓊脂培養基，搖勻，平行重復2次，按菌落計數法測定供試品本底菌數。

3.1.4 陰性對照組 取試驗用的稀釋液(pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液)1 mL，注入平皿內，并傾入培養基，凝固，倒置培養。每種計數用的培養基各平行制備2個平皿。

3.2 培養基稀釋法測定(金黃色葡萄球菌)

3.2.1 試驗組 取供試液1 mL等量分注5個平皿內，試驗菌加1 mL，傾注15～20 mL瓊脂培養基，搖勻，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法計數。

3.2.2 菌液組 測定所加的試驗菌數，取試驗菌注入平皿內，并傾注15～20 mL瓊脂培養基，搖勻，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法計數。

3.2.3 供試品對照組 取供試液1 mL等量分注5個平皿內，并傾注15～20 mL瓊脂培養基，搖勻，平行制備2個平皿，按菌落計數法測定供試品本底菌數。

3.2.4 陰性對照組 取試驗用的稀釋液0.2 mL，注入無菌平皿內，傾入培養基，恒溫培養。

3.3 分別統計上述各組菌落數，分別計算每株試驗菌的回收率，結果見表1。

表1 3批熊膽茵陳顆粒的菌種回收率試驗結果

4 控制菌的測定

4.1 大腸埃希菌的檢查

4.1.1 膽鹽乳糖培養基增菌 試驗組：取膽鹽乳糖培養基100 mL，加入供試液10 mL及大腸埃希菌菌懸液1 mL。供試品對照組：取膽鹽乳糖培養基100 mL，加入供試液10 mL。陰性對照組：取膽鹽乳糖培養基100 mL，加入稀釋液10 mL。上述各組于30～35℃培養18～24 h，必要時則延長至48 h。

4.1.2 大腸埃希菌檢查 按《中國藥典》(2010版)規定的“微生物限度檢查法”，將上述3組培養、觀察，結果見表2。結果表明：按照常規法，3批樣品大腸埃希菌試驗組均可檢出試驗菌，陰性組及陰性菌對照組無菌生長。

表2 大腸埃希菌檢查結果

4.2 大腸菌群的檢查

4.2.1 試驗分組 試驗組：取3批供試液各1 mL和大腸桿菌試驗菌液，于10 mL膽鹽乳糖(BL)發酵培養基內。陰性菌對照組：取三批供試液各1 mL和金黃色葡萄糖球菌試驗菌液，置10 mL膽鹽乳糖(BL)發酵培養內。陰性對照組：取三批供試液各1 mL和pH7.0蛋白胨-氯化鈉緩沖液1 mL置10 mL膽鹽乳糖(BL)發酵培養基內。

4.2.2 大腸菌群檢查 按《中國藥典》(2010版)規定的“微生物限度檢查法”將上述3組分別進行培養、觀察，結果見表3。結果表明：按照常規法，3批大腸菌群試驗組均可檢出試驗菌，陰性組及陰性對照菌均無菌生長。

表3 大腸菌群檢查結果

4.3 沙門菌的檢查 分別取本品10 g 加入3瓶200 mL營養肉湯中，1瓶加入1 mL沙門菌菌液作為試驗組，1瓶加入1 mL金黃色葡萄球菌菌液作為陰性菌對照組，另取1瓶加入1 mL沙門菌菌液作為沙門菌陽性對照組，按沙門菌檢查法檢查。

表4 沙門菌檢查結果

由表可知，陰性對照組未檢出沙門菌，試驗組可檢出沙門

菌。可采用常規法進行本品的沙門菌檢查。

5 討論

根據《藥典》規定，微生物限度檢查回收率試驗中，若試驗組的菌回收率不低于70%，則照該供試液制備方法和計數法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌的菌數；若低于70%，可能存在抑菌現象，可嘗試培養基稀釋法。結合預實驗及本試驗結果，本品細菌用培養基稀釋法檢查，霉菌、酵母菌用常規法測定即可[4-6]。

控制菌檢查驗證時，陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌；若試驗組檢出試驗菌，按此供試液制備方法和控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查。由試驗結果可知，可用常規方法進行控制菌的檢查。

[1]李煌，徐偉，鄭海音，等.復方熊膽茵陳顆粒質量標準研究[J].中國中醫藥信息雜志，2013，20(9)：52-54.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].一部.北京：化學工業出版社，2010.

[3]吳宗彬.重感靈片微生物限度檢查及控制菌檢查方法驗證[J].河北醫學，2007，13(7)：831-834.

[4]何進，高軍，白楊，等.參黃流感顆粒微生物限度檢查方法的驗證[J].藥學服務與研究，2012，12(1)：76-78.

[5]杜鳳霞，劉峰群，張詩龍，等.復方青花顆粒微生物限度檢查方法的驗證[J].解放軍醫藥雜志，2012，24(8)：50-52.

[6]劉淑娟，馮梅.金蓮清熱顆粒微生物限度檢查法驗證[J].北方藥學，2014，11(10)：10-11.

Microbial Limit Test and Control Bacteria Method Validation ofCompoundBearBileandCapillaryHerbGranule

WU Zhong1, ZHANG Xun1, KONG Xiang-jia1, XU Wei1, HONG Zhen-feng2

(1.SchoolofPharmacy,FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,Fuzhou350122,Fujian;2.SchoolofChinese-WesternMedicineIntegration,FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,Fuzhou350122,Fujian)

Objective: To establish a microbial limit test method forCompoundBearBileandCapillaryHerbGranuleto ensure accurate and reliable test results. Methods: Bacteria recovery rate tests and control bacteria method validation were conducted according to Chinese Pharmacopoeia. Results: The rate of five recovery tests was more than 70%, wherein the bacteria were checked by culture medium dilution method. Yeasts and molds could go in the conventional method. In the control bacteria check, test organisms could be detected from Escherichia coli, coliform bacteria and Salmonella groups and no bacteria growth was in Gram-negative group. There was also no bacteria growth in the negative control. Conclusion: The method established in the test may provide a basis for microbial limit test and control bacteria method validation ofCompoundBearBileandCapillaryHerbGranule.

CompoundBearBileandCapillaryHerbGranule, microbial limit, control bacteria check

福建省科技重大專項(NO：2010YZ0001-1)

R285.5

A

1007-2349(2015)07-0066-03

2015-03-16)

△通信作者：洪振豐，E-mail：wzrenwz@sohu.com。