裸鼠胰腺癌USPIO和MSLN-USPIO的MR成像對照研究

潘璜 王鐵功 侯毅斌 陳士躍 劉敬禹 田建明 邵成偉

·論著·

裸鼠胰腺癌USPIO和MSLN-USPIO的MR成像對照研究

潘璜 王鐵功 侯毅斌 陳士躍 劉敬禹 田建明 邵成偉

目的研究利用隱形納米脂質體包裹的Mesothelin抗體修飾的超小超順磁性氧化鐵(MSLN-USPIO)作MRI靶向對比劑診斷裸鼠皮下種植胰腺癌的可能性和價值。方法制作多時間節點荷人胰腺癌裸鼠模型，分別使用USPIO和MSLN-USPIO作為MRI對比劑進行3.0T MRI掃描，比較二者對最小種植瘤的顯示陽性率、種植瘤組織T2WI的負性強化率；通過種植瘤標本普魯士藍染色，觀察種植瘤組織中鐵離子沉積。結果兩種對比劑顯示最小腫瘤的陽性率差異無統計學意義；使用USPIO增強后左、右腋窩腫瘤的負性強化率分別為(12.29±7.45)%和(11.06±5.91)%，使用MSLN-USPIO增強后左、右腋窩腫瘤的負性強化率分別為(33.88±6.09)%和(43.29±11.64)%，兩組種植瘤增強前后的信號值差異及同一部位種植瘤增強后的負性強化率差異均有統計學意義(P值均<0.05)，且MSLN-USPIO組的負性強化率顯著高于USPIO組(P<0.05)。普魯士藍染色顯示MSLN-USPIO組種植瘤組織內的鐵顆粒沉積明顯多于USPIO組。結論MSLN-USPIO的增強效果明顯優于USPIO，可作為荷瘤裸小鼠胰腺癌MRI 靶向對比劑。

胰腺腫瘤； 超微超順磁性氧化鐵； 小鼠，裸； 磁共振成像

MRI是臨床診斷腫瘤的重要手段之一，為了進一步提高MRI對軟組織的分辨率，使病變顯影更加清晰，可采用MRI對比劑增強不同組織的對比度。除了最常用的釓噴替酸葡甲胺(Gd-DTPA)之外，目前較廣泛應用的是超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide，SPIO)或超小(ultrasmall)SPIO(USPIO)類對比劑進行磁共振免疫成像(magnetic resonance immunoimaging，MRII)以提高疾病的診斷率。MRII是以順磁性物質為示蹤劑標記到抗人腫瘤單克隆抗體(McAb)上，利用McAb與腫瘤抗原的特異性結合，使順磁性物質選擇性濃聚于腫瘤局部，從而在MRI中產生靶向增強，實現腫瘤定向特異性強化的一種新的成像方法，是實現腫瘤的早期定性和定量診斷的無創成像技術[1]。本研究將USPIO用隱形納米脂質體包裹并連結到Mesothelin McAb(MSLN-USPIO)作為對比劑，對荷人胰腺癌裸鼠進行MRI成像研究，探討MSLN-USPIO對胰腺癌的免疫靶向增強成像效果。

資料與方法

一、人胰腺癌裸鼠皮下異位種植模型建立及分組

BALB/C裸小鼠14只，雌雄不限，4～5周齡，體質量(18±2)g，SPF級 ，購自第二軍醫大學實驗動物中心。人胰腺癌細胞株SW1990由上海長海醫院消化內科實驗室提供，常規培養傳代。取對數生長期細胞，制備成2×107/ml密度的細胞懸液，取0.2 ml注射于裸鼠皮下，第1天注射于左腋窩皮下、第8天注射于右腋窩皮下、第15天注射于右腹股溝皮下，第22天行MRI掃描。掃描前對每只裸鼠的3枚種植瘤用游標卡尺測量長、短徑，計算相應體積，并將14只裸鼠按右側腹股溝腫瘤體積從大到小的順序編號，以腫瘤體積相近的2只裸鼠配成一對，然后根據隨機數字表法給每只裸鼠分配一個隨機數字，在每對內按數字大小排序，將各對中的較大數字的裸鼠接受USPIO增強掃描，納入USPIO組，較小數字的裸鼠接受MSLN-USPIO增強掃描，納入MSLN-USPIO組。兩組各有7只裸鼠。

二、MRI檢查

裸鼠用1%戊巴比妥鈉溶液按0.01 ml/g體質量行腹腔注射麻醉，俯臥位置于GE SIGNA 3.0T MR儀的Mouse線圈中心掃描。先行平掃T1WI及T2Mapping序列冠狀位掃描，掃描范圍覆蓋3枚腫瘤。根據本課題組前期的實驗研究，USPIO增強于30 min達強化峰值，MSLN-USPIO增強于4 h達強化峰值。USPIO組自尾靜脈團注USPIO(商品名Superavist?，德國拜耳先靈醫藥股份有限公司生產)0.1 mmol Fe3+/kg體質量，30 min后行增強掃描，序列為T2Mapping冠狀位；MSLN-USPIO組自尾靜脈團注MSLN-USPIO(0.09735 mmol Fe3+/ml，第二軍醫大學藥學院合成)0.1 mmol Fe3+/kg體質量，4 h后行增強掃描，序列為T2Mapping冠狀位。

MR掃描序列T1WI參數為重復時間(TR)3 000 ms，回波時間(TE) 24 ms，激勵次數(NEX) 2次，層厚2 mm，層間距0.2 mm，視野(FOV) 6 mm，矩陣320×256；T2Mapping參數為TR/TE=1 000/83.4 ms，NEX 1次，層厚2 mm，層間距0.2 mm，FOV 6 mm，矩陣320×256。

三、圖像分析

所有圖像經2名經驗豐富的高年資醫師分別獨立審閱，記錄所有腫瘤的MRI檢查結果。

測量平掃及增強后T2Mapping圖像上各部位腫瘤及肌肉信號強度，測量時盡量避免血管影的干擾。感興趣區(region of interest，ROI)選取在同一部位，測量3次，取均值；背景區域選取較大的ROI，測背景噪聲的標準差(standard deviation noise，SDN)。計算平掃后肌肉的信噪比(signal noise ratio，SNR)和各部位腫瘤增強后的負性強化率(negative enhancement rate, NEn%)，計算公式為SNR=SIM/SDN，NEn%=(SIT1- SIT2)/SIT1×100%，公式中SIT、SIM分別代表腫瘤、肌肉的信號強度，SIT1、SIT2分別代表腫瘤平掃、增強后的信號強度。兩名醫師結果不一致處經討論后達成一致意見。

四、組織病理學檢查

裸鼠于MR檢查結束后采用頸椎脫臼法處死，摘取皮下腫瘤標本，置10%甲醛液中固定24 h，行石蠟包埋、切片、HE染色及普魯士蘭染色，光鏡下觀察標本的組織學改變。

五、統計學處理

應用SPSS 13.0統計軟件包行統計學分析。兩組裸鼠右側腹股溝皮下種植瘤MRI增強掃描陽性率的比較采用Fisher確切概率法，平掃后肌肉的SNR及腫瘤的信號值比較采用配對t檢驗，兩組裸鼠之間的腫瘤負性強化率比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、裸鼠種植瘤成瘤率

14只裸鼠均存活，共種植42枚腫瘤，成瘤率100%。22 d時左、右腋窩及右腹股溝處的瘤體長徑分別為212～1 664、39～671、5～60 mm，體積分別為(771±411)、(207±131)、(17±12)mm3。種植瘤標本經組織病理學檢查證實為同一種類型腫瘤。

二、種植瘤MRI檢查的陽性率

14只裸鼠左腋窩及右腋窩皮下種植瘤在MRI平掃及增強后均可檢出。USPIO組7只裸鼠右腹股溝皮下種植瘤僅檢出3枚；MSLN-USPIO組裸鼠檢出4枚。兩組裸鼠右腹股溝皮下種植瘤檢出率的差異無統計學意義。

三、裸鼠MRI增強前后肌肉信噪比

USPIO組裸鼠MRI平掃T2Mapping序列肌肉信號值測量為483.19±87.52，增強后為437.38±60.43，增強后肌肉信號減低約45.81；MSLN-USPIO組平掃T2Mapping序列肌肉信號值測量為538.69±78.95，增強后為478.31±59.92，其信號值增強后較平掃減低約60.38。兩組肌肉平掃SNR分別為7.37±0.86和7.92±1.81，增強后SNR為6.96±0.99和7.41±2.03，增強前后SNR的差異均無統計學意義(t值分別為1.537、1.966，P值均>0.05)。

四、裸鼠各部位種植瘤的負性強化率

USPIO組裸鼠左腋窩種植瘤平掃T2Mapping信號值為1428.41±173.62，增強后掃描信號值為1248.19±148.18，較平掃時顯著下降(t=3.732，P=0.010)，其負性強化率為(12.29±7.45)%；MSLN-USPIO組種植瘤平掃T2Mapping信號值為1391.39±303.02，增強后掃描信號值為918.51±212.45，較平掃顯著降低(t=-9.624，P=0.000)，其負性強化率為(33.88±6.09)%。兩組種植瘤的負性強化率差異有統計學意義(t=-5.937，P=0.000，圖1)。

USPIO組右腋窩種植瘤平掃T2Mapping信號值為1570.02±192.41，增強后掃描信號值為1399.11±217.67，較平掃時顯著下降，差異有統計學意義(t=4.956，P=0.003)，其種植瘤的負性強化率為(11.06±5.91)%；MSLN-USPIO組種植瘤平掃T2Mapping信號值為1308.59±225.86，增強后信號值為725.51±103.54，較平掃時顯著降低，差異有統計學意義(t=-6.236，P=0.001)，其負性強化率為(43.29±11.64)%，兩組種植瘤的負性強化率差異有統計學意義(t=-6.534，P=0.000，圖1)。

圖1 USPIO組(上)和MSLN-USPIO組(下)平掃T1WI(1A)及T2WI(1B)均可見左、右腋窩及右側腹股溝皮下種植瘤(箭頭)，增強后T2WI(1C)見種植瘤信號降低

兩組裸鼠因右腹股溝皮下種植瘤體積小、容積效應影響信號值測量的準確性，且MRI掃描陽性檢出率低，故未作此項統計學分析。

五、種植瘤普魯士藍染色

USPIO組種植瘤組織內可見少量散在分布的鐵顆粒，呈藍色；MSLN-USPIO組腫瘤組織中可見大量鐵顆粒分布(圖2)。

討 論

胰腺癌是一種起病相對較隱匿、預后不良的惡性腫瘤，高場MRI檢查對胰腺癌具有重要意義。但胰腺癌有時表現與正常胰腺組織的信號相似，對比度較差，尤其早期胰腺癌的小病灶常難以被發現，有些胰腺癌雖有較明顯的異常信號，但其信號特征缺乏特異性，診斷與鑒別診斷仍有困難。為了提高MRI檢查的敏感度和特異性，使用理想的MR靶向性對比劑提高圖像的信噪比及特異性地改變靶組織信號十分必要。MR靶向性對比劑能有效提高MRI檢測微小或隱匿病灶的能力，同時能反映靶器官的組織變化，是國內外分子影像學研究的一個重要方向[2]。

圖2 USPIO組(2A)、MSLN-USPIO組(2B)種植瘤內鐵顆粒(普魯士藍染色 ×400)

USPIO是一種優于SPIO的常用免疫成像示蹤劑，其核心是直徑僅20 nm的Fe3O4或Fe2O3晶體。它在血漿內停留時間長，易通過毛細血管壁，從而具備廣泛的組織分布，使其更適合用于MR免疫成像。本研究用來包裹USPIO的脂質體(liposome)是具有類似生物膜結構的磷脂雙分子層小囊泡，平均直徑為20～400 nm，囊內為含液的空腔，可以起到載體的作用，攜帶抗生素、化療藥和對比劑等[3-4]。良好的表面活性使其表面能夠進行各種修飾，從而避開免疫系統的監視，靶向分布于各種特定的組織[5]。隱形脂質體(或長循環脂質體)是經過聚乙二醇(PEG)共軛修飾，增加脂質體的柔順性和親水性，能逃避網狀內皮系統的吞噬，減少脂質體脂膜與血漿蛋白的相互作用，有效延長其在血液中的半衰期[6]、明顯提高其總體靶向標記率。隱形脂質體有利于肝脾以外的組織或器官的靶向作用，同時，將抗體或配體結合在PEG的末端，既可保持長循環，又可保持對靶體的識別。

MRI免疫成像中將USPIO以隱形脂質體包裹，再將抗人腫瘤的單克隆抗體(McAb)聯結到脂質體PEG上，制成分子探針McAb-USPIO，即靶向對比劑。由于抗體與相應的腫瘤抗原能特異性結合，所以注入體內的分子探針能與靶腫瘤細胞緊密結合，形成局部大量對比劑沉積，再通過 MRI掃描即可發現信號降低的腫瘤病灶；而正常組織或非靶腫瘤組織由于缺乏分子探針的有效結合，僅有微少的對比劑沉積于組織間隙，在MRI掃描中造成的信號降低并不明顯，與靶腫瘤相比負性強化率非常小。大量的研究表明，Mesothelin是人胰腺癌細胞表面具有較高特異性的抗原蛋白[7]，因此本研究采用Mesothelin抗體與USPIO研制成MSLN-USPIO作為胰腺癌靶向對比劑，即是以隱形脂質體包裹USPIO并與Mesothelin單克隆抗體聯結[8]，其平均粒徑僅189.6 nm，分散度為0.136，具備較好的實驗特性。

本實驗前期針對USPIO和MSLN-USPIO對裸鼠皮下種植胰腺癌增強掃描的最佳強化時間進行了研究。將USPIO和MSLN-USPIO分別通過尾靜脈注入裸鼠體內后10、30、60、120、240、360 min重復掃描，發現USPIO的最佳強化時間為30 min，而MSLN-USPIO的最佳強化時間為240 min，故本研究兩組裸鼠采用了不同的MR增強掃描時間。

本課題組曾采用裸鼠多時間節點皮下種植瘤模型得到處于不同生長時期、體積大小相異的腫瘤，且觀察到腫瘤的體積與其生長時間是呈正相關的[9]。由于體積較大的腫瘤容易觀察，為了明確MSLN-USPIO是否能提高早期腫瘤的檢出率，所以本研究采用了按裸鼠右腹股溝腫瘤體積分組的方法，結果發現相對于平掃和USPIO增強，MSLN-USPIO并不能提高微小腫瘤(裸鼠右腹股溝腫瘤)的檢查陽性率，這可能與3.0T臨床型MRI的信噪比及掃描層厚限制有關，動物專用的超高場MRI是否能解決這一難題有待進一步研究。此外，使用USPIO與MSLN-USPIO增強掃描后，腫瘤周圍正常的肌肉組織的負性強化并不明顯，表明無論是USPIO還是MSLN-USPIO對正常組織均無明顯強化作用。USPIO對腫瘤組織有一定的強化效果，但MSLN-USPIO的負性強化率是USPIO的3～4倍，表明聯結腫瘤單克隆抗體的靶向對比劑確實有助于大幅度提高MRI對腫瘤的分辨力。腫瘤切片的普魯士藍染色同樣顯示在MSLN-USPIO組腫瘤組織中的鐵顆粒沉積明顯多于USPIO組腫瘤，也就從病理方面證實了MSLN-USPIO能有效提高USPIO與靶細胞的結合率。所以，MRI免疫成像可幫助確定腫瘤的性質，甚至推斷腫瘤的組織學類型[10]。

[1] Gupta H, Weissleder R. Targeted contrast agents in MR imaging[J]. Magn Reson Imaging Clin N Am, 1996,4(1):171-184.

[2] Atri M. New technologies and directed agents for applications of cancer imaging[J]. J Clin Oncol, 2006,24(20):3299-3308.

[3] Barrett T, Kobayashi H, Brechbiel M, et al. Macromolecular MRI contrast agents for imaging tumor angiogenesis[J]. Eur J Radiol, 2006,60(3):353-366.

[4] 呂國士, 許乙凱. 脂質體MRI 對比劑的研究進展[J]. 國外醫學·臨床放射學分冊, 2006,29(1):1-4.

[5] 姜慶軍, 劉士遠, 肖湘生. MRI 靶向對比劑載體的研究近況[J]. 臨床放射學雜志, 2003,22(9):801-803.

[6] Park YS. Tumor-directed targeting of liposomes[J]. Biosci Rep, 2002,22(2):267-281.

[7] 潘璜，吳紅玉，陳士躍，等. 三種胰腺癌細胞株Mesothelin的表達及成瘤速度的比較[J]. 中華胰腺病雜志, 2012,12(5):326-328.

[8] Deng Li, Ke X, He Z, et al. A MSLN-targeted multifunctional nanoimmunoliposome for MRI and targeting therapy in pancreatic cancer[J]. Int J Nanomedicine, 2012,7: 5053-5065.

[9] 潘璜，邵成偉，田建明. 多時間節點荷人胰腺癌SW1990細胞裸鼠模型的建立及其MRI表現[J]. 中華胰腺病雜志, 2012,12(2):123-125.

[10] Anderson SA, Rader RK, Westlin WF, et al. Magnetic resonance contrast enhancement of neovasculature with alpha(v)beta(3)-targeted nanoparticles[J]. Magn Reson Med, 2000,44(3):433-439.

(本文編輯：呂芳萍)

MR study with USPIO and MSLN-USPIO in the nude mouse model bearing human pancreatic carcinoma

PanHuang,WangTiegong,HouYibin,ChenShiyue,LiuJingyu,TianJianming,ShaoChengwei.

DepartmentofRadiology,The171thHospitalofPLAofChina,Jiujiang332000,China

ShaoChengwei,Email:cwshao@sina.com

Objective To study the potential and value of ultrasmall superparamagnetic iron oxide (USPIO) conjugated by mesothelin antibody as MRI targeting contrast agent for diagnosis of implanted human pancreatic carcinomas in nude mouse. Methods Nude mouse tumor models bearing multiple human pancreatic carcinomas at different time points was established and they were randomized into two groups, and USPIO or MSLN-USPIO were used as contrast enhanced agents in the 3.0T MRI scan, respectively, then the positive detection rates for smallest tumors, and the signal intensity of tumors in T2mapping images of both unenhanced and contrast enhanced scanning and the negative enhancement rate were measured, then Prussian blue staining was performed in all the tumor specimens to observe the difference of Fe3+ion deposition. Results There was no statistical significance between USPIO group and MSLN-USPIO group in the positive detection rates for smallest tumors. In USPIO group, the negative enhancement rate of left or right axilla tumors was (12.29±7.45)% and (11.06±5.91)%, and they were (33.88±6.09)% and (43.29±11.64)% in MSLN-USPIO group. There was statistical significance in the difference of signal intensity between unenhanced and contrast enhanced in left or right axilla tumors (P<0.05), and the negative enhancement rate in MSLN-USPIO group was significantly higher than that in USPIO group (P<0.05). The Fe3+ion deposition in tumors’ tissue in MSLN-USPIO group was significantly more than that in USPIO group. Conclusions The enhanced effect of MSLN-USPIO is superior to USOPIO, and it can be a tumor targeted MR contrast enhanced agent for the diagnosis of pancreatic carcinoma in nude mouse.

Pancreatic neoplasm； Ultrasmall superparamagnetic iron oxide； Mice, nude; Magnetic resonance imaging

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.03.008

國家自然科學基金資助項目(30970801)

332000 江西九江，中國人民解放軍第一七一醫院放射科(潘璜)；廣州醫科大學附屬腫瘤醫院放射科介入病房(侯毅斌)；第二軍醫大學長海醫院放射科(王鐵功、陳士躍、田建明、邵成偉)，第二軍醫大學附屬長海醫院介入治療科(劉敬禹)

共同第一作者：王鐵功

邵成偉，Email: cwshao@sina.com

2015-01-26)