MicroRNA-429對TGF-β1誘導的大鼠胰腺星狀細胞活化和上皮-間質轉化的調控作用

徐岷 王國英 趙義 蔡菁 倪鑫 劉鑫 張行行 張尤歷

·論著·

MicroRNA-429對TGF-β1誘導的大鼠胰腺星狀細胞活化和上皮-間質轉化的調控作用

徐岷 王國英 趙義 蔡菁 倪鑫 劉鑫 張行行 張尤歷

目的探討miR-429對大鼠胰腺星狀細胞(PSCs)活化和上皮-間質轉化(EMT)的調控作用。方法用組織塊法提取、培養和分離PSCs，通過免疫熒光染色法檢測結蛋白(desmin)、神經膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達鑒定PSCs。取新鮮分離的第2代PSCs，采用脂質體法將miR-429的模擬物(miR-429 mimic) 和無意義小分子陰性對照片段(miR-NC)分別轉染大鼠PSCs，再用10 μg/L TGF-β1刺激PSCs。采用蛋白質印跡法檢測細胞a-SMA、波形蛋白(vimentin)、E-鈣黏蛋白(E-cad)及EMT相關蛋白TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3的表達量；實時熒光定量PCR法檢測a-SMA、vimentin、E-cad mRNA和miR-429的表達量。結果培養后PSCs細胞體積變大，偽足發達，細胞間連接減少，脂滴消失， GFAP、desmin 表達陽性，α-SMA表達陰性，符合星狀細胞的生物學特征。TGF-β1刺激后，大鼠PSCs α-SMA、vimentin、E-cad蛋白的表達量分別為對照組的(1.369±0.878)、(1.518±0.041)、(0.549±0.076)倍，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。轉染miR-429 mimic且經TGF-β1刺激后，PSCs的α-SMA、vimentin、E-cad mRNA表達量是轉染miR-NC組的(0.423±0.038)、(0.652±0.043)、(2.235±0.045)倍，蛋白表達量是(0.683±0.053)、(0.548±0.049)、(1.548±0.038)倍，差異均有統計學意義(P<0.05或<0.01)；TGF-β/Smad通路的TGF-β1、p-Smad2/3的相對表達量是miR-NC組的(0.459±0.038)、 (0.525±0.029)倍，差異均有統計學意義(P<0.05或<0.01)。結論上調miR-429的表達可減弱TGF-β1對大鼠PSCs活化的影響及逆轉EMT，其可能的機制是抑制TGF-β1介導的TGF-β/Smad信號轉導通路。

微RNAs； 轉化生長因子β1； 胰腺星形細胞； 上皮-間質轉化

上皮-間質轉化 (epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指細胞逐漸喪失上皮細胞特征而獲得間質細胞特征的轉化過程，它是可逆的[1]。在EMT時，細胞表面上皮標志物E-鈣黏蛋白(E-cad)表達下調，間質標志物波形蛋白(vimentin)表達上調，導致上皮細胞失去細胞極性，胞間連接被破壞，胞內肌動蛋白骨架重構[2-3]。EMT是胰腺纖維化過程的早期階段，而活化的胰腺星狀細胞(PSCs)是胰腺纖維化的核心環節。研究表明，PSCs在靜息狀態下保持著上皮細胞的特征，激活后向肌成纖維細胞轉化，這一過程被認為是 EMT 現象[4]。文獻報道，TGF-β1可刺激PSCs轉化為肌成纖維樣細胞[5-6]。微小RNA(microRNA, miR)對EMT的調控作用亦越來越引起國內外學者的關注，其中miR-200家族是最重要的一類[7]。本研究采用TGF-β1活化PSCs，將miR-429轉染PSCs，觀察miR-429轉染對TGF-β1刺激的大鼠PSCs活化和EMT修改蛋白表達的影響，探討miR-429調控EMT的機制。

材料和方法

一、原代PSCs分離和培養

苯巴比妥鈉腹腔注入麻醉SD雄性大鼠，75%乙醇消毒后于超凈臺內快速分離出胰腺，去除周圍脂肪組織，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗干凈后剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小組織塊，加入少量含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基均勻接種于培養瓶中，置于37℃、5%CO2培養箱孵育1 h，更換培養基，以后每2～3 d更換培養基一次。培養24 h后組織塊周圍有細胞爬出，5～7 d細胞開始快速增殖，進行傳代，取第二代PSCs作為研究對象。

二、免疫熒光染色法鑒定PSCs

將細胞均勻接種于24孔板，每孔1×103個細胞，貼壁后用4%多聚甲醛4℃固定過夜，0.3% TritonX-100處理8 min，加3% BSA 37℃孵育1 h，分別加抗α-平滑肌肌動蛋白(a-smooth muscular actin,α-SMA)、結蛋白(desmin)、神經膠質原纖維酸性蛋白(gilal fibrillary acidic protein, GFAP)一抗，4℃過夜，加熒光標記二抗，37℃孵育1 h，核熒光染色37℃ 30 min，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

三、TGF-β1刺激PSCs及miR-429轉染

取對數生長期PSCs，以3×105個細胞密度接種于培養瓶中，貼壁后加入TGF-β1(終濃度為10 μg/L)刺激72 h，以未處理細胞作為對照。收集細胞備用。

取對數生長期PSCs，以每孔1×105個細胞密度接種于6孔培養板，加不含抗生素的培養基培養24 h，待細胞融合度達70%左右時用脂質體LipofectamineTM2000將miR-429模擬物(miR-429 mimic，廣州銳博生物公司合成)轉染細胞，以轉染無意義小分子片段(miR-NC)作為陰性對照，按試劑盒說明書操作。miR-NC及miR-429 mimic用量為50 nmol/L。轉染24 h后加入TGF-β1(終濃度為10 μg/L)刺激48 h，觀察細胞轉染率及細胞形態，并收集細胞備用。

四、蛋白質印跡法檢測蛋白表達

收集各組細胞，裂解液裂解提取細胞總蛋白，BCA法定量，常規行蛋白質印跡法檢測α-SMA、E-cad、vimentin、TGF-β1、Smad2/3、磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)蛋白表達。抗α-SMA、E-cad、vimentin單抗購自英國Abcam公司，抗TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3單抗購自美國Cell Signaling Techmology公司，最后ECL化學發光，X線片曝光、顯影、定影。用凝膠成像系統掃描分析，以目的蛋白與內參條帶吸光度值比作為目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次，取均值。

五、熒光定量PCR檢測mRNA表達

采用Trizol試劑提取各組細胞總RNA，先逆轉錄合成cDNA，再行熒光定量PCR檢測α-SMA、E-cad、vimentin mRNA和miR-429的表達量。引物序列：β-actin上游5′- CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游5′- TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′；α-SMA上游5′-CGATAGAACACGCATCATCAC-3′，下游5′-GCATAGCCCTCATAGATAGGCA-3′；vimentin上游5′-GGGAGGAGAGCAGGATTTCT-3′，下游5′-TCTTTTGGAGTGGGTGTCAAC-3′；E-cad上游5′-TCCTCCTGCTCCTACTGTTTCT-3′，下游5′-TCCACCTCCCTCTTCATCATAG-3′；miR-429及內參U6引物由廣州銳博生物公司設計合成。PCR反應條件：95℃ 20 s，95℃ 10 s、60℃ 20 s、72℃ 10 s，40個循環。采用公式2-ΔΔCt計算mRNA的相對表達量。實驗重復3次，取均值。

六、統計學分析

結 果

一、大鼠PSCs的形態學改變及鑒定

培養1 d后，PSCs向四周伸出觸角，呈星形或梭形，胞核與胞質比例較大，脂滴豐富，透光度好；培養3 d后，細胞星形外觀最明顯；1周后體積變大，偽足增多，脂滴基本消失(圖1)。免疫熒光染色后鏡下見約90%的細胞desmin和GFAP陽性表達，而α-SMA幾乎不表達，符合星形細胞的細胞表型(圖2)。

二、PSCs α-SMA、vimentin、E-cad蛋白表達量的變化

TGF-β1刺激72 h后，PSCs的α-SMA、vimentin蛋白的相對表達量增加，分別為對照組的(1.369±0.878)、(1.518±0.041)倍，而E-cad蛋白的相對表達量下降，為對照組的(0.549±0.076)倍，差異均有統計學意義(P值均<0.05，圖3)。

三、PSCs miR-429表達量的變化

TGF-β1刺激組PSCs的miR-429表達量顯著下降，為對照組的(0.35±0.06)倍，差異有統計學意義(P<0.01)。

圖1 原代培養1(1A )、3(1B )、7d(1C)的PSCs(×100) 圖2 PSCs的α-SMA(2A)、desmin(2B)、GFAP(2C)蛋白表達(免疫熒光×100)

圖3 對照組(1)和TGF-β1刺激組(2)PSCs 的α-SMA、vimentin和E-cad蛋白表達

四、 miR-429轉染對經TGF-β1刺激的PSCs的a-SMA、vimentin、E-cad mRNA和蛋白表達影響

轉染miR-NC并經TGF-β1刺激后，PSCs的α-SMA、vimentin、E-cad mRNA表達量分別為未轉染細胞的(0.959±0.154)、(1.105±0.135)、(1.105±0.382)倍，蛋白表達量分別為未轉染細胞的(0.983±0.045)、(0.897±0.038)、(0.926±0.325)倍，差異均無統計學意義(P值均<0.05)。轉染miR-429并經TGF-β1刺激后，PSCs的α-SMA、vimentin mRNA表達量分別為轉染miR-NC并經TGF-β1刺激組的(0.423±0.038)、(0.652±0.043)倍，蛋白表達量分別為(0.683±0.053)、(0.548±0.049)倍，均顯著下降，差異均有統計學意義(P<0.05或<0.01，圖4)；E-cad mRNA表達量為miR-NC組的(2.235±0.045)倍，蛋白表達量為(1.548±0.038)倍，均顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05或<0.01，圖4)。

圖4 未轉染組(1)、轉染miR-NC組(2)、轉染miR-429組(3)經TGF-β1刺激后PSAs的α-SMA、vimentin、E-cad蛋白表達

五、miR-429轉染對經TGF-β1刺激的PSCs TGF-β/Smad通路蛋白表達的影響

轉染miR-429并經TGF-β1刺激后，PSCs的TGF-β1和p-Smad2/3表達量分別為轉染miR-NC并經TGF-β1刺激組的(0.459±0.038)、(0.525±0.029)倍，均顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05或<0.01，圖5)。

圖5 未轉染組(1)及轉染miR-NC(2)、miR-429(3)并經TGF-β1刺激后PSAs的TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表達

討 論

近年來大量研究揭示PSCs在胰腺慢性纖維化的進程中具有重要作用，是多種誘因作用的靶點，激活的PSCs引起細胞外基質(ECM)大量沉積，最終導致胰腺纖維化的形成[4, 8]。參與胰腺纖維化的細胞因子較多，目前起重要作用而且研究較多的主要是TGF-β1。研究表明，TGF-β1是一種重要的成纖維生長因子，具有刺激特定細胞分裂增殖的能力。TGF-β1可刺激PSCs轉化為肌成纖維樣細胞，合成大量的細胞外基質沉淀于胰腺間質中，促進胰腺纖維化的發生；且TGF-β1能夠促進肌纖維細胞產生膠原，與胰腺纖維化的發生密切相關[5-6]。本研究結果顯示，TGF-β1刺激后PSCs的E-cad蛋白表達量顯著下調，而α-SMA和vimentin蛋白的表達顯著上調，提示TGF-β1可使PSCs由原來的上皮樣特性轉化為肌成纖維樣細胞，即發生了EMT。

在多細胞生物中，miRNA 通過不完全互補的方式結合到靶基因 mRNA的3′端非翻譯區的特異序列，抑制靶基因 mRNA的翻譯，同時伴隨靶基因mRNA水平的降低[9]。microRNA也被證實參與復雜的生理過程，如胚胎形成、器官發育和腫瘤的形成。外源性miRNA-200家族誘導E-cad的表達和EMT過程。相反，抑制miRNA-200家族表達可減少E-cad的表達量和增加間質標志物 vimentin、ZEB1和ZEB2的表達量[10]。本研究結果顯示，轉染miR-429后，PSCs的α-SMA和vimentin蛋白表達量下調，而E-cad蛋白表達量上調，提示miR-429可誘導活化的PSCs發生EMT。

研究發現，自分泌TGF-β1/ZEB/miR-200信號網絡系統調控著細胞在上皮細胞狀態和間質細胞狀態之間轉化的可塑性，在ZEBs和TGF-β間是正相關，而在miR-200和TGF-β以及 TGF-β和miR-200之間是負相關[11]。TGF-β/Smad信號通路是促進EMT的主要信號通路。TGF-β1和TGF-β2均可誘導大鼠NRK52E細胞的纖維形成和EMT的發生，其機制是通過下調miR-200a的表達，繼而影響Smad3的活性和基質蛋白的表達[12]。本研究結果顯示，轉染miR-429 又經TGF-β1刺激的PSCs的TGF-β1及p-Smad2/3的表達量較單純TGF-β1刺激的PSCs明顯減少，提示miR-429可抑制TGF-β1介導的TGF-β/Smad信號轉導通路。但miR-429是否通過抑制TGF-β/Smad信號轉導通路來逆轉活化的PSCs和EMT，還有待通過阻斷該通路觀察EMT相關蛋白的表達來進一步證實。

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(本文編輯：呂芳萍)

中國醫師協會胰腺病學專業委員會學術年會暨第17次遼寧省醫學會消化病

專委會學術會議通知

由中國醫師協會胰腺病學專業委員會主辦、遼寧省醫學會、沈陽醫學會和《中華胰腺病雜志》編輯部協辦，沈陽軍區總醫院承辦的“中國醫師協會胰腺病專委會學術年會暨第17次遼寧省醫學會消化病專委會學術會議(2015，沈陽)”將于2015年7月24至26日在沈陽召開。本次學術會議是中國醫師協會胰腺病專委會成立以來的首次學術年會，將邀請國內外胰腺疾病研究領域的著名專家，采用多學科協作(MDT)論壇的形式，針對胰腺疾病(重點是急性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺腫瘤)基礎與臨床方面的新方法、新技術進行交流，匯集消化內科、消化內鏡、胰腺外科、影像醫學、病理科、中醫科等多學科專家的經驗和研究進展，系統介紹胰腺疾病的最新研究成果和診治新技術。會議期間，將討論定稿我國急性胰腺炎MDT診治共識意見，并成立胰腺病專委會的首屆青年委員會。屆時將邀請30余位國內著名專家作專題報告或會議主持，誠摯邀請消化界及相關領域各位同仁參會。

一、征文內容：胰腺疾病方面：(1)急性胰腺炎的病因、發病機制及臨床診治進展；(2)慢性胰腺炎的病因、發病機制及臨床診治進展；(3)重癥急性胰腺炎的診治進展；(4)胰腺癌的病因、發病機制及臨床診治進展；(5)胰腺囊性病變的病因、發病機制及臨床診治進展。征文要求：征文要求800字左右的中文摘要，內容包括目的、方法、結果和結論。并請注明作者姓名、單位、郵編及郵箱地址，文責自負。凡在國內學術會議上或全國公開發行的刊物上發表過的論文不予受理。截稿日期：2015年6月30日。

二、會務費：注冊費400元/人。

三、參會代表授予國家I類繼續醫學教育學分10分。

四、請于5月31日前將參會信息以傳真、電子郵件或信件形式寄至大會秘書處。或以手機短信形式告知大會秘書處。

五、大會秘書處: 沈陽市沈河區文化路83號沈陽軍區總醫院消化內科

聯系人：李宏宇、杜奕奇、劉旭，郵編：110840，傳真：024-28851113

電話：024-28851112、13309887041、13801993592、13352459045

Email：13309887041@163.com、duyiqi@hotmail.com、we1980@163.com

Effect of miR-429 on TGF-β1 induced activation and regulation of epithelial mesenchymal transition in rat pancreatic stellate cells

XuMin,WangGuoying,ZhaoYi,CaiJing,NiXin,LiuXin,ZhangXingxing,ZhangYouli.

DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang212000,China

ZHANGYou-li,Email:zjyouli1957@163.com

Objective To investigate the effect of miR-429 on activation of pancreatic stellate cells (PSCs) in rat and regulation of epithelial mesenchymal transition (EMT). Methods PSCs were isolated and cultured with tissue culture method and desmin, gilal fibrillary acidic protein (GFAP) and α smooth muscular actin (α SMA) were determined by immunofluorescence staining to identify PSCs. Freshly isolated PSCs of 2nd generation were used．MicroRNA-429 mimic or nonsense small molecular fragments (negative control, NC) were transfected into PSCs by liposomes. 10 μg/L TGF-β1 was applied to stimulate PSCs. The expression of α-SMA, vimentin, E-cad and EMT-related proteins, TGF-β1, Smad2/3, P-Smad2/3 protein was measured by Western blot. The expression of α-SMA, vimentin, E-cad mRNA and miR-429 was detected by quantitative real time PCR. Results After culture, the cell volume of PSCs increased, pseudopodia were developed, inter-cell connections were reduced, and lipid droplets disappeared. GFAP, desmin were positively expressed, and α-SMA was negatively expressed, which were consistent with PSCs biological properties. After TGF-β1 stimulation, the expression of α-SMA, vimentin, E-cad in rat PSCs was (1.369±0.878), (1.518±0.041), (0.549±0.076) folds higher than those in control group, and the difference between the two groups was statistically significant (P<0.05). After miR-429 mimic transfection and TGF-β1 stimulation, the expression of α-SMA, vimentin, E-cad mRNA was (0.423±0.038), (0.652±0.043), (2.235±0.045) folds higher than those in miR-NC group, and the expression of proteins was (0.683±0.053), (0.548±0.049), (1.548±0.038) folds higher than those in miR-NC group, and the difference between the two groups was statistically significant (P<0.05 or <0.01). The relative expression of TGF-β1, p-Smad2/3 were (0.459±0.038), (0.525±0.029) folds of those in miR-NC group, and the difference between the two groups was statistically significant (P<0.05 or <0.01).Conclusions Over expression of miR-429 significantly attenuates the PSCs activation induced by TGF-β1, and reverse the process of EMT, and the mechanisms may be inhibiting the TGF-β/Smad signaling pathway mediated by TGF-β1.

MicroRNAs; Transforming growth factor-beta 1; Pancreatic stellate cells; Epithelial-mesenchymal transition

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.03.004

江蘇省自然科學基金(BK20131247)；鎮江市“169四期工程”科研項目

212000 江蘇鎮江，江蘇大學附屬醫院消化內科

張尤歷，Email：zjyouli1957@163.com

2014-09-02)