胡椒中提取純化胡椒堿的工藝研究

徐士明，關永霞，朱祥霞，武洪英

(1.臨沂市生產力促進中心，山東 臨沂 276000;2.中藥制藥共性技術國家重點實驗室，山東 臨沂 276000)

胡椒為胡椒科植物胡椒(Piper nigrum L.)的干燥近成熟或成熟果實，可用作調味劑、防腐劑、健胃劑、解熱劑、利尿劑和支氣管粘膜刺激劑等［1］。胡椒堿(C17H19NO3)為胡椒的主要活性成分，具有抗腫瘤 、抗氧化 、抗消化系統潰瘍 、抗抑郁 、免疫調節等作用［2］。目前，有關胡椒中胡椒堿的提取研究已經較為深入和系統。文獻報道的有關胡椒堿的提取方法主要有:酸水提取［3］、乙醇提取［4］、甲醇提取［5］、微波蒸餾提取［6］、超聲提取［7］、二氧化碳超臨界提取［8］等，其中酸水提取效率低，提取液后期處理比較繁瑣，只適用于胡椒堿的粗提;甲醇提取率較高，但其毒性較大，工業生產不安全;微波和二氧化碳超臨界提取效率較高，但設備貴，成本高;超聲提取率較低，設備貴，有噪音污染。石寶俊等［9］用乙醇回流提取胡椒，本研究優化乙醇回流提取參數，考察結晶條件，篩選最佳產業化工藝，制備純度大于98%的純品。

1 材料與儀器

1.1 材料 胡椒(購自海南省萬寧市，經中藥制藥共性技術國家重點實驗室李守信高級工程師鑒定為胡椒科植物胡椒Piper nigrum L.);酒精(95%，食用級);甲醇(色譜純，國藥集團化學試劑有限公司，批號:20130621);胡椒堿對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號:110775－201104);無水乙醇(AR級，國藥集團化學試劑有限公司，批號:20140605)。

1.2 儀器 Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000高效液相色譜儀，Ultimate 3000紫外檢測器，Ultimate 3000 Chromeleon 7數據處理系統;150搖擺式高速中藥粉碎機(浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司);ME204電子天平(梅特勒－托利多儀器有限公司);ZKSY型恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責任公司);R1020EX旋轉蒸發儀(20L，鄭州長城科工貿有限公司);DZF－6050型真空干燥箱(上海博迅實業有限公司醫療設備廠);2XZ－2型旋片式真空泵(浙江臺州真空泵有限公司);300L搪玻璃反應釜(河南永信搪瓷化工設備有限公司)。

2 實驗方法

2.1 分析方法

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取胡椒堿對照品10.59mg，置100mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，精密移取此溶液10mL，分別置于25mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋定容至刻度，即得。

2.1.2 色譜條件 色譜柱:Symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm);流動相:甲醇－水 =77∶23，檢測波長343 nm。柱溫為30℃;進樣量10μL;流速為1.0mL·min－1。胡椒堿此條件下的保留時間約為14min。

2.1.3 標準曲線的繪制 精密稱取胡椒堿對照品10.59mg，置100mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并定容至刻度，搖勻;精密移取此溶液 1、2、4、10、20mL，分別置于25mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋定容至刻度。以峰面積為縱坐標，對照品進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程:Y=30.749X－10.679，r=0.9999，結果表明胡椒堿濃度在 4.236～84.72 μg·mL－1范圍內，胡椒堿的峰面積和進樣量成良好的線性關系。

2.2 提取條件優化

2.2.1 胡椒預處理的考察 準確稱取胡椒粒和胡椒粉各100g，胡椒粒首先利用85%乙醇浸泡24 h，然后回流提取2次。胡椒粉直接利用85%乙醇加熱回流提取2次。兩者提取時間均為2 h，料液比均為1∶10，將提取液按不同倍數稀釋，按“2.1”項下方法測定含量，結果見表1。

由表1可知，未粉碎胡椒，雖然浸泡24 h，但是提取效率極低，不適合提取操作。根據藥典方法檢測，本藥材中胡椒堿含量為4.11%;粉碎后的胡椒粉回流提取2次總含量可達3.89 g，提取率超過94%，說明粉碎后胡椒堿基本提取完全，胡椒堿提取時需要對胡椒進行粉碎。

表1 胡椒粉碎對胡椒堿提取率的影響

2.2.2 提取次數的考察 稱取胡椒粉2份，各100g，分別加入10倍量85%乙醇溶液，回流提取3次，每次2 h，合并濾液，稀釋后，按“2.1”項下方法測定含量，結果見表2。

表2 提取次數對胡椒堿提取率的影響

由表2可知，回流提取2次即可達到最佳效率。

2.2.3 乙醇濃度的考察 稱取胡椒粉9份，各100g，分別加入10倍量不同濃度乙醇溶液，回流提取2次，每次 2 h，合并濾液，稀釋后，按“2.1”項下方法測定含量，結果見圖1。

圖1 乙醇濃度對胡椒堿提取率影響

由圖1可知，乙醇濃度在55%～85%之間時，隨著乙醇濃度的增加，胡椒堿提取量上升，當乙醇濃度達到85%時，提取量最高，達到3.87 g，之后隨乙醇濃度升高，提取含量反而降低，表明乙醇濃度85%時提取效果最好。

2.2.4 料液比的考察 稱取胡椒粉9份，各100g，選用不同料液比，加85%乙醇溶液回流提取2次，每次2 h，合并提取液，稀釋后，按“2.1”項下方法測定含量，結果見圖2。

由圖2可知，隨著提取液體積的增加，胡椒堿提取量逐漸增加，當料液比在1∶10時，胡椒堿已經基本提取完全，隨著提取液體積繼續增加，提取量增加不明顯，從成本方面考慮，采用料液比1∶10即可保證提取率，適合產業化生產操作。

圖2 不同料液比對胡椒堿提取率影響

2.2.5 提取時間的考察 稱取胡椒粉8份，各100g，分別加入10倍量濃度85%乙醇溶液，回流提取1次，設定不同提取時間，將提取液稀釋后，按“2.1”項下方法測定含量，結果見圖3。

圖3 提取時間對胡椒堿提取率影響

由圖3可知，隨著提取時間的延長，胡椒堿提取量逐漸增加，當提取時間達2 h后，提取量基本不增加，時間繼續延長，提取總含量反而略有降低，所以選擇最佳提取時長為2 h。

2.3 結晶條件優化

2.3.1 1次結晶條件的考察 提取液濃縮至無醇味，靜置12 h后析出長棱狀晶體，說明胡椒堿可以在濃縮液結晶析出。為進一步優化1次結晶條件，選用常溫靜態(室溫靜置)、低溫靜態(0～4℃靜置)、低溫動態(冰水浴攪拌)3種結晶條件進行考察，將1次結晶樣品作為供試品檢測，結果見表3。

表3 不同結晶條件效果考察

由表3可知，不同的結晶條件，結晶時間、晶型、收率有所不同。低溫動態結晶晶型稍差，但結晶速度快、生產周期短，且收率遠遠超過靜態結晶，為最佳1次結晶條件。

2.3.2 重結晶條件的考察 低溫動態一次結晶品用少量冰乙醇淋洗，胡椒堿的含量約70% ～85%，為進一步提高純度，需進行重結晶。本試驗選擇了石油醚、乙酸乙酯、丙酮、無水乙醇、無水乙醇5種不同極性的溶劑進行重結晶考察，將重結晶樣品作為供試品檢測，結果見表4。

表4 重結晶溶劑考察

由表4可知，乙酸乙酯、無水乙醇、無水甲醇可以作為重結晶溶劑，其中乙醇毒性低，屬于環境友好型溶劑，適用于產業化生產，所以最終選定無水乙醇作為重結晶溶劑，所得胡椒堿純度大于98%(見圖4)。

圖4 供試品的高效液相色譜圖

3 結果與討論

本文以胡椒為試驗材料，考察乙醇提取的最佳工藝，與傳統酸提堿沉工藝相比，提取物后期處理簡單，產品純度高，對環境污染小。試驗采用高效液相色譜(HPLC)法測定提取物中胡椒堿的純度和提取率，作為參考指標優化工藝條件。試驗結果顯示，由于胡椒果實堅硬不容易浸透，所以為保證胡椒堿提取率，提取前需要經過粉碎處理。乙醇提取胡椒堿最佳工藝條件為料液比1∶10，乙醇濃度85%，回流提取2次，每次2 h，提取率可達96%。1次結晶方式為低溫動態結晶，結晶速度快，收率高;通過考察胡椒堿和雜質在不同溶劑中的溶解度，綜合考慮結晶晶型、溶劑毒性和環保等方面，最終選用無水乙醇作為重結晶溶劑，胡椒堿重結晶后純度可達98%以上。本胡椒堿提取純化工藝步驟少，使用儀器簡單，操作方便，生產周期短，產品純度高。提取采用乙醇作為有機溶劑，可重復回收利用，降低生產成本。通過中試工藝驗證，收率穩定，說明生產工藝穩定可靠，能夠滿足工業化生產要求，適 合大規模生產。

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