脂多糖致帕金森病動物模型研究進展

何 歡，吳 霞

(首都醫科大學中醫藥學院，中醫絡病研究北京市重點實驗室，北京 100069)

1 神經炎癥與帕金森病

帕金森病(Parkinson's disease，PD)，又名震顫麻痹，1817年由英國醫生James Parkinson首先系統描述，常見于中老年人，60歲以上的人群中約2%患有帕金森病，是繼阿爾茨海默病之后的第二個最常見的神經系統變性疾病。其病理特點是中腦多巴胺(DA)能神經元的丟失，以及α-突觸核蛋白(α-synuclein)為主要成分的路易小體的形成［1］。當中腦黑質致密部多巴胺能神經元丟失大約50%，紋狀體內多巴胺濃度降低80%時出現臨床癥狀［2］，包括運動遲緩、震顫、強直、姿勢步態失調等運動癥狀，以及嗅覺障礙、植物神經功能紊亂、抑郁、認知及睡眠障礙等非運動相關的癥狀。目前，PD的發病機制仍不是很清楚，其主要機制涉及氧化應激、線粒體功能障礙、興奮性毒性、神經營養因子缺乏及免疫調節異常等。近些年的研究表明神經性炎癥能明顯促進帕金森病的進程，尤其是小膠質細胞的激活及促炎性因子、神經毒素的表達，能引起帕金森病患者多巴胺能神經元的丟失［3，4］。小膠質細胞作為中樞神經系統常駐免疫細胞，主要參與腦內的固有免疫反應，能夠清除細胞碎片和外來異物，發揮免疫監視功能。當腦組織出現感染、外傷、缺血或是神經變性疾病引起的神經元損傷時，小膠質細胞會被迅速激活，形態逐漸發生改變，從靜止的網狀結構變成運動的阿米巴形狀，并釋放大量炎癥因子。對于小膠質細胞激活后是發揮神經保護作用還是產生神經毒性作用，一直沒有定論［5］。一方面，激活的小膠質細胞通過釋放神經營養因子和抗炎因子發揮保護作用;另一方面，大量激活的小膠質細胞通過產生大量氧自由基，如超氧化物、細胞內活性氧、過氧化氫、羥自由基、一氧化氮(NO)以及細胞毒性因子，如白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子 - α(TNF- α)、前列腺素 E2(PGE2)等損傷神經元［3］。此外，損傷的神經元會繼續引起小膠質細胞的過度激活，從而在神經元凋亡和小膠質細胞激活之間形成一種惡性循環，導致更多的神經元變性死亡［4］。臨床研究發現，在PD患者的黑質紋狀體系統中確實存在激活的小膠質細胞［6］。因此，研究PD進程中的炎癥反應是必要的，它可以幫助我們理解PD的病理機制并研究有效的治療藥物。

在過去20年間，PD動物模型的研究表明，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的神經炎癥可以復制一些PD的特征，包括小膠質細胞的過度激活以及黑質紋狀體系統多巴胺能神經元選擇性損傷［7～10］。LPS為革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，是重要的內毒素，能刺激機體產生炎癥反應。研究表明LPS進入到腦中可以結合小膠質細胞膜上的CD14樣受體，激活Toll樣受體4，由此引起小膠質細胞的激活，從而導致神經元的損傷［11］。

2 不同部位給予LPS致PD動物模型

2.1 黑質內注射LPS 中腦黑質區域分布著多巴胺能神經元和大量小膠質細胞，1998年，Casta?o等［7］報道了黑質內注射LPS造成PD大鼠模型。在黑質區域立體定位注射LPS后，發現了小膠質細胞激活，并且黑質部位多巴胺能神經元缺失，試驗結果表明炎癥反應尤其是小膠質細胞的激活對PD的病理進程有重要影響。小膠質細胞為腦內常駐免疫細胞，正常狀態下起到免疫監視作用，其形態為靜止的分叉狀，當接觸到致炎因子后，小膠質細胞會過渡到棒狀的激活狀態，繼而變成阿米巴樣的完全激活狀態。急慢性黑質內注入LPS實驗表明，LPS可以誘導小膠質細胞激活，并且有劑量和時間依賴性［12，13］。Herrera 等［14］在隨后的研究中，通過觀察注射LPS一年后大鼠黑質多巴胺能神經元存活情況，證明LPS誘導的多巴胺能神經元損毀是不可逆的。而且，LPS對DA能神經元的損害作用具有選擇性，可以觀察到LPS在損毀黑質DA能神經元的同時，γ-氨基丁酸(GABA)能神經元和5-羥色胺(5-HT)能神經元并不受影響。此后，更多的研究證實了上述結果，并發現在注射LPS后，黑質部位促炎性細胞因子包括IL-1β、TNF-α、IL-6和NO等水平增高，這些促炎性細胞因子可能是LPS致神經元損傷的起因［15～17］。此外，黎鋼等［18］探究了 LPS 對大鼠行為學和單胺類遞質的影響，結果表明LPS注入黑質特異性損害DA能神經元，可降低紋狀體DA及其代謝產物含量，阿樸嗎啡可誘導大鼠產生旋轉行為。

LPS立體定位注射到中腦黑質區域可更好模擬小膠質細胞激活和神經元損傷之間的相互作用，有利于研究黑質區域炎癥對PD病理變化的影響。

2.2 蒼白球內注射LPS 蒼白球是位于大腦兩側半球深部的基底核的重要組成部分，基底核是錐體外系的中繼核，可以將來自大腦皮質、丘腦等處的神經沖動經蒼白球發出纖維至丘腦而與大腦皮質聯系。蒼白球的下行纖維，通過紅核、黑質、網狀結構等影響脊髓下運動神經元。因此，基底核作為一個整體，蒼白球可以影響到黑質紋狀體的通路和功能。目前已有研究結果表明LPS注射到蒼白球可模擬PD的生化及行為改變，如大鼠活動減少、運動遲緩、黑質紋狀體系統中酪氨酸羥化酶陽性神經元減少、多巴胺含量降低、小膠質細胞持續活化等。Zhang等［8］將LPS立體定位注射到大鼠蒼白球，試驗結果顯示黑質和蒼白球區域小膠質細胞均被激活，黑質致密部TH陽性神經元及其蛋白表達顯著減少，并且大鼠自主活動減少。也有研究發現蒼白球注射LPS的大鼠促炎性細胞因子水平顯著升高，包括IL-1β、TNF-α和IL-6，誘導型一氧化氮合酶表達增多，并增強了α-synuclein在黑質的聚集。與低齡大鼠比較，上述病理變化在中年大鼠中更顯著，該結果也支持了老齡化是帕金森病的一個誘因的觀點［19］。

2.3 紋狀體內注射LPS 在黑質紋狀體系統中多巴胺能神經元的胞體位于黑質內，而其富含多巴胺遞質的神經纖維分布在紋狀體內。研究發現LPS注射到大鼠紋狀體后，黑質多巴胺能神經元胞體和紋狀體軸突末端逐漸變性死亡，紋狀體內多巴胺含量降低，α-synuclein和泛素蛋白在神經元細胞質內積聚，并且大鼠出現行為學障礙［10，20，21］。Hunter等［22］將LPS立體定位注射到C57/B6小鼠紋狀體內，試驗結果表明LPS能夠致小鼠多巴胺能神經元變性缺失，并且呈劑量和時間依賴性，在小鼠紋狀體分別注射 5、7.5、10 μg 的 LPS，1周后TH陽性神經元缺失分別達到23%、45%、61%，注射5 μg LPS，4周后TH陽性神經元缺失達到72%、12周后達到81%，并且多巴胺含量顯著降低，與對照組相比，LPS組小鼠在轉棒上停留的時間明顯降低。該研究成功復制了PD相關癥狀的小鼠模型。

紋狀體內注射LPS可引起神經毒性，其分子機制可能有多種，包括黑質和紋狀體區域內小膠質細胞的激活、線粒體損傷、以及 IL-1β、TNF- α、IL-6、IL-1α、NO 等促炎性細胞因子的釋放。這表明紋狀體內的炎癥刺激不僅直接損害紋狀體內多巴胺能神經元軸突末端，還間接損傷黑質內多巴胺能神經元胞體，其具體信號傳導通路有待進一步研究［10，20，22］。

2.4 腦室內注射LPS 李軍泉等［23］通過腦室注射 LPS激活腦內炎癥反應，觀察腦內炎癥變化情況，大鼠行為學改變，以及對黑質多巴胺能神經元的影響。結果表明腦室注射LPS后能引起腦室內小膠質細胞的廣泛激活，其激活程度隨時間而逐漸增高，注射后24 h激活程度最高。黑質部位小膠質細胞激活要晚于紋狀體及海馬，說明腦室注射LPS后炎癥反應在腦內由近及遠擴散。Zhou等［24］將LPS注射到大鼠單邊側腦室，在不同時間點觀察LPS的長期神經毒性作用。第4周在海馬和紋狀體的小膠質細胞被激活，而在第24周黑質內小膠質細胞才被激活，TH陽性神經元出現胞體萎縮死亡。α-synuclein在第12周聚集增多，并在24周達到最多，反常的運動行為在第16周出現并持續到了48周。此研究結果表明，側腦室內注射LPS與黑質或紋狀體內局部注射LPS建立的大鼠模型不同，本模型能更好地模擬PD的慢性漸進性變性過程，多巴胺能神經元的損傷較為緩慢，具有時間依賴性。

2.5 腹腔內注射LPS 全身系統性炎癥曾被懷疑能否影響腦內免疫細胞激活進而促進PD的神經退行性病變。但有研究表明C57BL/6J小鼠腹腔注射LPS可引起小膠質細胞的激活和多巴胺能神經元退行性病變，7個月和10個月時多巴胺能神經元丟失分別為23%和43%［25］。腹腔注射的LPS不能進入中樞神經系統引起炎癥，早期文獻報道內毒素LPS注射到大鼠體內不能破壞血腦屏障的通透性［26］。然而一些促炎性因子包括TNF-α和IL-1，可以通過血腦屏障，直接影響中樞神經系統功能［27］。

細菌內毒素LPS，作為一種小膠質細胞激活劑，當以腹腔注射的形式應用時，會將腦部一些不同區域的小膠質細胞激活，不僅僅是黑質部位，例如LPS也應用于阿爾茲海默病炎癥模型［28］，因此，腹腔注射LPS致PD多巴胺能神經元退行性病變的分子機制需要進一步研究。

2.6 經鼻吸入LPS 經鼻通路連接鼻子和大腦，避開了血腦屏障，因此，空氣中的一些毒性物質可以通過經鼻通路進入大腦，影響大腦的功能。2013年，有學者通過LPS經鼻吸入途徑成功制備了小鼠PD模型［29］，每只小鼠隔天右側經鼻滴注LPS 10 μg，時間為5個月，實驗結果表明LPS單側經鼻吸入可引起小鼠運動功能減退，黑質多巴胺能神經元丟失及α-synuclein的沉積，紋狀體內TH表達減少及DA等神經遞質釋放減少。該模型呈現了PD的典型特征，可以用來研究慢性炎癥介導的PD發病機制以及發現以小膠質細胞-神經元相關聯的PD治療方法。李艷花等［30］采用LPS長時間、低劑量滴鼻方式給予C57BL/6小鼠，亦成功獲得了理想的PD模型，結果顯示鼻腔吸入LPS可以誘導小鼠運動功能改變，引發黑質多巴胺能神經元的丟失、激活小膠質細胞及其NF-κB信號通路。

3 小結

根據LPS不同作用部位，可以將LPS致PD模型概括為兩類，第一類為LPS直接局部注射到黑質紋狀體系統或其相關結構，例如LPS立體定位注射到黑質、紋狀體、蒼白球和腦室;第二類為LPS間接地全身給藥，選擇性影響黑質紋狀體系統，例如腹腔注射LPS和經鼻吸入LPS。研究表明，由于多巴胺能神經元與小膠質細胞在共同區域，且多巴胺能神經元更容易受到炎癥介導的神經元損傷，因此第一類模型更容易導致多巴胺能神經元的選擇性損傷。黑質立體定位注射LPS，可以直接誘導小膠質細胞的激活，造模時間短，但是由于黑質結構小，定位較難，且容易導致局部機械性損傷。紋狀體、蒼白球和腦室內注射LPS不會引起黑質局部機械性損傷，但其成模時間較長。第二類模型中，LPS如何致使黑質紋狀體系統多巴胺能神經元選擇性死亡至今仍不是很清楚，其具體分子機制需要進一步研究。因此第一類模型更適合應用于炎癥介導PD的病因學研究。

PD模型的建立在闡明PD發病機制、發現藥物作用靶點、新藥研發和篩選等方面具有重要意義，因此，建立一個穩定可靠的PD實驗模型對研究PD的發病和治療顯得尤為重要。大量研究表明，以小膠質細胞激活為代表的免疫炎癥在PD的發生和發展中扮演重要作用。在LPS致PD動物模型中，LPS可刺激小膠質細胞激活，引發神經炎癥，誘導黑質多巴胺能神經元產生一系列病理生理變化，能較好的模擬PD發病機制中的免疫炎癥機制，為研究PD進程中的炎癥反應奠定了基礎。此外，LPS致PD動物模型也為篩選以神經炎癥為靶點的PD治療藥物提供了可靠的工具。

［1］張美蓉，孫芳玲，艾厚喜，等.帕金森病的炎癥及抗炎藥物的研究進展［J］.中國康復理論與實踐，2012，18(11):1040-1043.

［2］Toulouse A，Sullivan AM.Progress in Parkinson's disease—Where do we stand?［J］.Prog Neurobiol，2008，85(4):376-392.

［3］Kim YS，Joh TH.Microglia，major player in the brain inflammation:their roles in the pathogenesis of Parkinson's disease［J］.Exp Mol Med，2006，38(4):333-347.

［4］BlockmL，Zecca L，Hong JS.Microglia-mediated neurotoxicity:uncovering the molecular mechanisms［J］.Nat Rev Neurosci，2007，8(1):57-69.

［5］任怡，葉民.膠質細胞與帕金森病免疫/炎癥機制的關系［J］.臨床神經病學雜志，2014，27(1):70-71.

［6］Imamura K，Hishikawa N，Sawada M，et al.Distribution of major histocompatibility complex class II-positive microglia and cytokine profile of Parkinson's disease brains［J］.Acta Neuropathol，2003，106(6):518-526.

［7］Casta?o A，Herrera AJ，Cano J，et al.Lipopolysaccharide intranigral injection induces inflammatory reaction and damage in nigrostriatal dopaminergic system［J］.J Neurochem，1998，70(4):1584-1592.

［8］Zhang J，Stanton DM，Nguyen XV，et al.Intrapallidal lipopolysaccharide injection increases iron and ferritin levels in glia of the rat substantia nigra and induces locomotordeficits［J］.Neuroscience，2005，135(3):829-838.

［9］Qin L，Wu X，BlockmL，et al.Systemic LPS causes chronic neuroinflammation and progressive neurodegeneration［J］.Glia，2007，55(5):453-462.

［10］Choi D Y，Liu M，Hunter RL，et al.Striatal neuroinflammation promotes Parkinsonism in rats［J］.PLoS One，2009，4(5):e5482.

［11］Lehnardt S，Massillon L，Follett P，et al.Activation of innate immunity in the CNS triggers neurodegeneration through a Toll-like receptor 4-dependent pathway［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100(14):8514-8519.

［12］Liu B，Jiang JW，Wilson BC，et al.Systemic infusion of naloxone reduces degeneration of rat substantia nigral do-paminergic neurons induced by intranigral injection of lipopolysaccharide［J］.J Pharmacol Exp Ther，2000，295(1):125－132.

［13］Gao HM，Jiang J，Wilson B，et al.Microglial activation －mediated delayed and progressive degeneration of rat nigral dopaminergic neurons:relevance to Parkinson's disease［J］.J Nurochem，2002，81(6):1285 －1297.

［14］Herrera AJ，Castano A，Venero JL，et al.The single intranigral injection of LPS as a new model for studying the selective effects of inflammatory reactions on dopaminergic system［J］.Neurobiol Dis，2000，7(4):429 －447.

［15］Lu X，Bing G，Hagg T.Naloxone prevents microglia－induced degeneration of dopaminergic substantia nigra neurons in adult rats［J］.Neuroscience，2000，97(2):285－291.

［16］Hernández－ Romero MC，Argüelles S，Villarán RF，et al.Simvastatin prevents the inflammatory process and the dopaminergic degeneration induced by the intranigral injection of lipopolysaccharide［J］.J Neurochem，2008，105(2):445－459.

［17］Arimoto T，Choi D，Lu X，et al.Interleukin－10 protects against inflammation－mediated degeneration of dopaminergic neurons in substantia nigra［J］.Neurobiol Aging，2007，28(6):894 －906.

［18］黎鋼，孫圣剛，曹學兵，等.脂多糖注入黑質對大鼠黑質紋狀體單胺類遞質和行為的影響［J］.中風與神經疾病雜志，2004，21(1):16 －18.

［19］Choi DY，Zhang J，Bing G.Aging enhances the neuroinflammatory response and α－synuclein nitration in rats［J］.Neurobiol Aging，2010，31(9):1649－1653.

［20］Hunter RL，Dragicevic N，Seifert K，et al.Inflammation induces mitochondrial dysfunction and dopaminergic neurodegeneration in the nigrostriatalsystem［J］.J Neurochem，2007，100(5):1375 －1386.

［21］Hunter RL，Choi DY，Kincer JF，et al.Fenbendazole treatment may influence lipopolysaccharide effects in rat brain［J］.Comp Med，2007，57(5):487 －492.

［22］Hunter RL，Cheng B，Choi DY，et al.Intrastriatal lipopolysaccharide injection induces parkinsonism in C57/B6 mice［J］.J Neurosci Res，2009，87(8):1913 －1921.

［23］李軍泉，張進祿，徐群淵.腦室注射脂多糖引起腦內炎癥反應及其對黑質多巴胺能神經元影響的研究［A］.中國神經科學學會第四次會員代表大會暨第七屆全國學術會議論文集［C］.2007.

［24］Zhou Y，Zhang Y，Li J，et al.A comprehensive study on long－term injury to nigral dopaminergic neurons following intracerebroventricular injection of lipopolysaccharide in rats［J］.J Neurochem，2012，123(5):771 －780.

［25］Perry VH.The influence of systemic inflammation on inflammation in the brain:implications for chronic neurodegenerative disease［J］.Brain Behav Immun，2004，18(5):407－413.

［26］Bickel U，Grave B，Kang YS，et al.No increase in blood–brain barrier permeability after intraperitoneal injection of endotoxin in the rat［J］.J Neuroimmunol，1998，85(2):131－136.

［27］Banks WA.Blood－brain barrier transport of cytokines:a mechanism for neuropathology［J］.Curr Pharm Des，2005，11(8):973 －984.

［28］Miklossy J.Chronic inflammation and amyloidogenesis in Alzheimer's disease－role of Spirochetes［J］.J Alzheimers Dis，2008，13(4):381 －391.

［29］He Q，Yu W，Wu J，et al.Intranasal LPS－mediated Parkinson's model challenges the pathogenesis of nasal cavity and environmentaltoxins［J］.PLoS One，2013，8(11):e78418.

［30］李艷花，和青，尉杰忠，等.硫辛酸對LPS誘導的帕金森病小鼠黑質多巴胺能神經元損傷的影響［J］.中國病理生理雜志，2015，31(2):201－206.