健神利水顆粒對腦出血大鼠神經功能損害及神經元細胞凋亡的影響

陳 煒，黃樹武，高玉廣，何 青，何乾超，黃德慶，張元侃，劉 泰

(廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530023)

腦出血急性期首發的病理改變主要為血腫和迅速發生的腦組織器質性損壞［1］，而繼發的病理改變主要是繼發的腦水腫、炎癥反應及血腦屏障的破壞和細胞凋亡等［2］。然而，動物實驗和臨床研究均發現，中等量的腦出血本身并不引起顱內壓的明顯升高，血腫周圍組織水腫和繼發性神經元損傷是影響患者預后的主要原因之一。目前尚未有藥物能夠確切地被證實可以有效地提高腦出血患者的功能恢復［3］。因此研究和開發安全有效的治療措施尤為重要且具深遠意義。而中藥復方以多成分、多環節、多層次、多靶點的藥理學作用見長，成為腦出血研究的熱點之一。我們前期的研究表明，健神利水方有較好的抗腦水腫作用［4］。本文研究了健神利水顆粒對實驗性腦出血大鼠神經功能損害及神經元細胞凋亡的影響，為其臨床應用提供更多的實驗依據。

1 材料

1.1 儀器 腦立體定位儀(ST－4ND，成都儀器廠);5、100μL 微量注射器;電子分析天平(Ohaus，AR2140);單反數碼照相機［Canon(中國)，型號:EOS550D］;石蠟切片機(Thermo Scientific公司，貨號:A78100001);組織包埋機(Thermo Scientific公司，貨號:A81000003);RSJ－1A生物組織染色機(天津天利航空機電有限公司);TP1020組織脫水機(徠卡顯微系統中國公司);ZKPJ－1A型展烤片機(天津天利航空機電有限公司)。

1.2 試藥 Tunel試劑盒(批號:11684817910，Roche公司);膠原酶Ⅶ(Lot#SL BG8830V，美國Sigma公司);PBS 緩沖液(pH 7.2 ～7.4)、0.01 mol·L－1枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH 6.0，博士德生物技術有限公司;DAB顯色試劑盒(博士德生物技術有限公司);健神利水顆粒(廣西中醫藥大學第一附屬醫院中心藥房);組方(白術10g、澤瀉 10g、豬苓 15 g、茯苓 15 g、桂枝 6 g、丹參15 g、三七3 g)系江陰天江藥業有限公司分別制成顆粒，以上7味中藥顆粒劑溶于50mL開水中，藥物濃度為 1.48 g·mL－1。

1.3 實驗動物 清潔級健康20～22月齡雄性Sprague－Dawley大鼠120只，購自廣西醫科大學實驗動物中心(動物合格證號:SCXK桂2009－0002)。

2 方法

2.1 模型的復制 采用計算機產生隨機序列。隨機分出假手術組、模型組、中藥組。模型組:大鼠術前4 h禁食，2 h禁水，經10%水合氯醛(3mL·kg－1)腹腔注射麻醉后，參照Rosenberg等［5］的方法，固定于立體定位儀上，使前囟和后囟在同一水平面上。于前囟后1mm，右側3mm處鉆一直徑約1mm的小孔，使用立體定位儀上的微量注射器進針6mm，即為右側尾狀核的位置。在10min內注入膠原酶Ⅶ0.5 U，注入完畢后停針5min，緩慢退針。假手術組:建立方法基本同膠原酶腦出血模型，但以等量生理鹽水代替膠原酶。中藥組:于模型建立3 h后灌服健神利水顆粒藥液，給藥量參照《現代醫學實驗動物學》計算，往后每天給藥1次，直至每個時間點被處死。其余各組灌予等劑量生理鹽水。各組造模后分6 h、24 h、3 d、7 d 4 個觀察點。

2.2 取材與處理 各組術后清醒大鼠按時間點以Gareia［6］評分法進行神經功能缺損評分后斷頭處死，剝離大腦組織，取出血側腦組織一部分進行腦水含量的測定。另一部分置于4%甲醛溶液中固定保存，制作石蠟切片后用于蘇木精－伊紅(HE)染色。

2.3 神經功能缺損評分 各亞組大鼠分別與造模前前天及以后的每個時間點進行神經功能缺損評分。參照Gareia評分法進行神經功能缺損評分，如表1。

表1 Gareia評分法

2.4 腦組織含水量測定 不同組別、不同時間點麻醉大鼠，斷頭處死，迅速取出腦組織，用刀片以針尖為中心取厚度約4mm出血側腦組織，立即稱濕重。將組織放入烘干箱100烘烤24 h再稱干重。按Elliot公式計算腦組織水含量:腦組織水含量(%)=(濕重－干重)/濕重×100%。

2.5 DNA斷裂的原位末端標記法(Tunel)檢測神經元凋亡 步驟:制作石蠟切片→脫蠟、水合→細胞通透→加TUNEL反應液→加converter－POD→與底物DAB反應顯色→光學顯微鏡計數并拍照(陰性細胞變小，胞膜完整但出現發泡現象，晚期出現凋亡小體，貼壁細胞出現鄒縮、變圓、脫落;而陽性細胞呈現染色質濃縮、邊緣化，細胞核呈深棕色)。

2.6 統計學方法 使用SPSS 19.0進行統計分析，多組間均數比較采用單因素方差分析(one－way ANOVA)，方差齊則行LSD(L)檢驗，方差不齊則取Tamhane's T2檢驗結果，P＜0.05具有統計學意義。

3 結果

3.1 神經功能缺損評分 腦出血大鼠清醒后，假手術組未出現明顯神經功能缺損，模型組出現嚴重神經功能缺陷。模型組和中藥組的神經功能缺損評分于3 d達到高峰，7 d逐漸下降。模型組各時間點神經功能缺損評分低于中藥組，但6 h時間點兩組差異無統計學意義(P＞0.05);24 h、3 d、7 d差異有統計學意義(P＜0.05)，說明健神利水顆粒能減輕腦出血大鼠的神經功能損害，結果見表2。

表2 各組大鼠腦出血后各時間點神經功能缺損評分情況(，n=10)

表2 各組大鼠腦出血后各時間點神經功能缺損評分情況(，n=10)

注:與假手術組比較，*P＜0.05;與模型組比較，▲P＜0.05

組別6 h 24 h 3 d 7 d假手術組 17.10 ±0.57 16.30 ±0.82 16.00 ±1.05 17.10 ±0.74膠原酶組 13.60 ±1.26* 8.30 ±0.82* 6.00 ±1.25* 9.30 ±1.50*中藥組 14.00 ±0.82* 12.00 ±1.25＊▲ 1.70 ±0.95＊▲ 12.50 ±1.96＊

3.2 腦組織含水量測定 大鼠腦出血術后不同時間點血腫周圍腦組織含水量的變化如表3所示。模型組各時間點的腦組織含水量與假手術組比較均有明顯升高，差異具有顯著性(P＜0.05);24 h后，中藥組腦組織水含量明顯低于模型組。說明大鼠腦出血術后均有不同程度的腦水腫。假手術組隨著時間推移腦水含量未見明顯變化，模型組與中藥組的腦水含量6 h時間點比較無明顯差異，差異無統計學意義(P＞0.05)，隨著時間的推移腦水含量逐漸升高，24 h明顯升高，3 d時達到最高峰，7天后逐漸下降。兩組比較差異有統計學意義(P＜0.05);說明健神利水顆粒能減輕腦出血大鼠的腦水含量。

表3 各組大鼠腦出血后各時間點腦水含量()(%，n=10)

表3 各組大鼠腦出血后各時間點腦水含量()(%，n=10)

注:與假手術組比較，*P＜0.05;與模型組比較，▽P＜0.05

組別6 h 24 h 3 d 7 d假手術組 76.30±1.06 77.80±1.81 78.20±1.55 76.40±1.17模型組 79.50±4.32* 85.30±1.70* 88.10±2.08* 84.20±1.40*中藥組 79.00±2.45* 81.20±1.03*▽ 82.20±1.48*▽ 80.70±0.95*▽

3.3 HE染色光鏡觀察結果 各組大鼠腦組織HE染色結果:假手術組變化不明顯，細胞核以及核膜清晰可見，未見明顯組織腫脹細胞壞死以及膠質細胞增生等情況發生;模型組和中藥組6 h可見血腫周圍腦組織充血腫脹，細胞疏松，24 h可以見出血部位液化，細胞壞死，組織水腫加重，血管周圍間隙增寬，以上表現在模型組3 d時間點時最明顯，見圖1，且伴有膠質細胞增生。隨著時間延長，至7 d時出血灶周圍組織水腫逐漸減輕，膠質細胞增生仍然存在，細胞壞死減輕。

圖1 3 d時間點各組HE染色結果(×200)

3.4 神經元凋亡情況 各時間點隨機視野觀察中，假手術組見少量凋亡細胞，模型組和中藥組各時間點陽性細胞數與假手術組比較有統計學差異(P＜0.05)，模型組和中藥組隨著腦出血時間的延長，凋亡數量均有不同程度的增加，以模型組增加比較明顯，并于3 d時達到高峰，見表4、圖2，7 d后逐漸減少。模型組與中藥組6 h時間點細胞凋亡數量比較差異無統計學差異(P＞0.05);模型組與中藥組24 h時間點以后比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。

表4 各組大鼠神經元凋亡情況(，n=10)

表4 各組大鼠神經元凋亡情況(，n=10)

注:與假手術組比較，*P＜0.05;與模型組比較，▽P＜0.05

組別6 h 24 h 3 d 7 d假手術組 55.10 ±13.88 80.40 ±6.40 94.70 ±11.12 75.40 ±11.52模型組 80.60 ±11.54* 151.80 ±11.48* 212.60 ±16.68* 164.90 ±18.60*中藥組 78.90 ±11.34* 93.80 ±12.27*▽119.90 ±10.41*▽ 96.80 ±19.17*▽

圖2 3 d時間點各組細胞凋亡情況(×400)

4 討論

腦組織出血后瘀血留滯腦絡，致氣化失調，使水液不行而滲于脈外，發為腦水腫。因此腦出血急性期腦水腫的中醫關鍵病機是:“腦中蓄血”和“腦內蓄水”。為“瘀水”互結致腦失其司知覺、司運動之機能而猝然出現偏癱、失語、偏麻、甚則昏迷的腦中風諸癥。治療宜“溫陽化氣，利水行瘀”。健神利水顆粒是以五苓散加三七、丹參制成。方中重用澤瀉為君，以其甘淡，直達腎與膀胱，利水滲濕。臣以茯苓、豬苓之淡滲，增強利水滲濕之功。佐以白術和茯苓健脾以運化水濕。原方五苓散治膀胱蓄水之證，本方加止血之三七以通脈行瘀，止血不留瘀。配丹參養血活血，改善微循環，共奏溫陽化氣、利水行瘀之功。其所治與腦出血、腦水腫的關鍵病機密切相關，故對促進急性腦出血患者神經功能及早恢復和提高日常生活質量有顯著療效。前期動物實驗研究［7，8］結果提示，本方對實驗性兔腦出血急性期的腦系數和腦含水量有降低作用，并能提高Na+－K+－ATP酶活力，減輕細胞毒性，保護血腦屏障。有研究發現［9］，腦出血后的小膠質細胞的激活具有神經毒性作用，而適度的激活則具有一定的神經保護作用。本實驗研究發現中藥組神經功能缺損、腦水含量、神經元細胞凋亡、血腫周圍的 小膠質細胞浸潤比膠原酶組輕，提示健神利水顆粒可能通過抑制炎癥反應而達到腦保護作用。

本研究發現，與中藥組相比，24 h以后模型組出現嚴重神經功能損害，腦水含量明顯升高，細胞浸潤及神經元細胞凋亡明顯增多。提示健神利水顆粒對腦出血具有較好的腦保護作用;本研究主要以組織形態學觀察健神利水顆粒方對實驗性腦出血大鼠的腦保護作用，尚缺乏對內源性神經干細胞的增殖分化及相關蛋白表達等研究。研究發現［10］腦出血可能與易患基因有關，這為今后研究腦出血的防治提供新的思路，因此今后應從免疫組化，免疫熒光技術，神經示蹤技術等進行研究本方的有效性，為其在臨床上的推廣提供可靠的實驗依據。

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