腸道腫瘤組織中C—erbB2基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)的分析

摘要：目的 探討腸道腫瘤中致癌基因C-erbB2啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)。方法 收集經(jīng)病理確診的40例腸癌患者甲醛固定的腸道腫瘤組織及相應(yīng)癌旁組織各40份；采用甲基化特異聚合酶鏈反應(yīng)（MSP）檢測(cè)C-erbB2基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)。結(jié)果 腸道腫瘤組織中C-erbB2基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率（52.5%）低于癌旁組織中存在的甲基化率（75.0%），兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；腫瘤不同分期和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間C-erbB2基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 所檢標(biāo)本顯示腸道腫瘤組織與癌旁組織間C-erbB2基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示C-erbB2低甲基化可能是C-erbB2蛋白高表達(dá)和腸癌發(fā)生的原因之一。

關(guān)鍵詞：C-erbB2；啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化；腸道腫瘤；甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)

現(xiàn)代分子生物學(xué)認(rèn)為腫瘤發(fā)生、發(fā)展的本質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)遺傳調(diào)控和表觀遺傳調(diào)控的紊亂[1]。表觀遺傳學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容之一就是DNA甲基化。在腫瘤細(xì)胞中，異常甲基化最大的特點(diǎn)是全基因組低甲基化和局部性（CpG島）高甲基化并存[2]，這既是癌癥發(fā)生的重要原因之一，也是癌癥良惡轉(zhuǎn)化的重要標(biāo)志。目前發(fā)現(xiàn)癌基因活化和抑癌基因失活都與基因甲基化異常有關(guān)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島過(guò)度甲基化作了大量研究，已確認(rèn)其為基因失活的一種重要機(jī)制[3]，但是對(duì)致癌基因甲基化狀態(tài)研究甚少。為探討C-erbB2基因甲基化狀態(tài)在腸道腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的變化規(guī)律和意義，明確腸道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及為預(yù)后判斷提供檢測(cè)指標(biāo)，本研究采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（MSP）分析，以初步了解腸道腫瘤及其癌旁組織C-erbB2基因CpG島甲基化的狀態(tài)。

1 資料與方法

1.1一般資料 2013年～2014年上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院行手術(shù)治療的40例腸道腫瘤患者的癌組織及其相應(yīng)的癌旁組織，其中男20例，女20例，年齡40～92歲。經(jīng)病理證實(shí)癌組織全部為腺癌，癌旁組織取自距腫瘤中心3cm處外觀正常的組織。臨床分期按UICC（國(guó)際抗癌聯(lián)合會(huì)）標(biāo)準(zhǔn)：T1期0例，T2～T3期38例，T4期2例。標(biāo)本于術(shù)中獲取，甲醛固定，置-70℃冰箱保存。

1.2儀器和試劑

1.2.1儀器 ①Universal 16R型臺(tái)式高速離心機(jī)（德國(guó)Hettich公司）；②Gene Quant Ⅱ型RNA/DNA Calculator（瑞典pharmacia Biotech公司）；③PTC-150型Mini CyclerTM （美國(guó)MJ RESEARC公司）。

1.2.2試劑 ①蛋白酶K（德國(guó)Merck K GaA公司）；②TE緩沖液（pH8.0）；③平衡酚（華美公司）；④氯仿：異戊醇（24：1）；⑤冷無(wú)水乙醇；⑥70%乙醇；⑦亞硫酸氫鹽修飾試劑盒CpGenome DNA Modification Kit（CHEMICON公司，Cat NO.S7820）；⑧10mmol/L dNTP，5U/μlTaq酶，25mmol/LMgCl2（上海生工生物工程公司）；⑨Agarose B Low EEO（Bio Basic Inc公司）；⑩Low MW DNA Marker-A（范圍25bp～500bp，Bio Basic Inc公司）；〇11引物由本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)，上海生工生物工程公司合成。序列如下：甲基化特異引物：上游引物（MF）序列為：5'-TTTTACGGGGTTTTTTATTGC-3'，下游引物（MR）序列為：5'-TAATACTCACTACGACTCCGACC-3'（產(chǎn)物120bp）；非甲基化特異引物：上游引物（UF）序列為：5'-TTTTTATGGGGTTTTTTATTGT-3'，下游引物（UR）序列為：5'-ATAATACTCACTACAACTCCAACC-3'（產(chǎn)物120bp）。野生型引物：上游引物（WF）序列為：5'-CCAGACTTGTTGGAATGC-3'，下游引物（WR）序列為：5'- AAGAGGGCGAGGAGGAG-3'（用于監(jiān)測(cè)亞硫酸氫鹽修飾效果，產(chǎn)物352bp）。

1.3方法

1.3.1組織標(biāo)本前處理 甲醛浸泡1w內(nèi)的組織塊剪碎后于PBS（ pH7.4）中浸泡1h，換新鮮PBS再浸泡24h，最后加TE緩沖液勻漿后轉(zhuǎn)入1.5ml Ep管中。

1.3.2基因組DNA抽提 采用本實(shí)驗(yàn)室試劑，用蛋白酶K消化-氯仿抽提法抽提組織DNA，以TE緩沖液溶解，并用紫外分光光度儀進(jìn)行定量。

1.3.3 C-erbB2基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)

1.3.3.1 DNA亞硫酸氫鹽修飾 取10μg DNA按修飾試劑盒CpGenome DNA Modification Kit的說(shuō)明書操作步驟進(jìn)行修飾。最后獲得TE緩沖液洗脫修飾好的DNA，置-20℃保存。

1.3.3.2 MSP MSP基本原理：DNA經(jīng)亞硫酸鹽處理后，未發(fā)生甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，甲基化的胞嘧啶不發(fā)生轉(zhuǎn)化，使用對(duì)甲基化和未甲基化DNA分別特異的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由此產(chǎn)生差異而加以區(qū)分[4]。PCR反應(yīng)時(shí)，其中一對(duì)引物序列針對(duì)甲基化目的片段，若DNA處理后用該對(duì)引物能擴(kuò)增出片段，說(shuō)明該檢測(cè)位點(diǎn)甲基化。兩對(duì)引物都與未處理DNA序列無(wú)互補(bǔ)配對(duì)，高度特異。

PCR反應(yīng)體系：修飾后DNA 200ng，10×Buffer 1μl，10mmol/L dNTP1μl，25mmol/LMgCl2 3.0μl ， MF和MR（20pmol/μl）各0.8μl或UF和UR（20pmol/μl）各0.8μl，Taq酶（5 U/μl）0.5μl，蒸餾水補(bǔ)至20μl。采用熱啟動(dòng)PCR，循環(huán)前95℃預(yù)變性5min后加入Taq酶，依次作如下循環(huán)（延伸條件均為72℃，30s）：①95℃，30s；66℃，30s；②95℃，30s；64℃，30s；③95℃，30s；62℃，30s；④95℃，30s；60℃，30s；⑤95℃，30s；58℃，30s；以上5組參數(shù)各行3次循環(huán)；⑥90℃，30s；56℃，30s；⑦90℃，30s；54℃，30s；⑧90℃，30s；53℃，30s；以上3組參數(shù)各行4次循環(huán)。（9）90℃，30s；52℃，30s；該組參數(shù)行20次循環(huán)，共計(jì)47個(gè)循環(huán)后72℃延伸5min。最后4℃保存。PCR反應(yīng)完畢，取5μl反應(yīng)產(chǎn)物，加1μl溴酚藍(lán)電泳指示液，于2.0%瓊脂糖凝膠上電泳30min，以低分子量DNA Marker作為電泳條帶參照，電泳結(jié)束后將凝膠置紫外燈箱觀察結(jié)果。甲基化特異引物對(duì)MF/MR擴(kuò)增陽(yáng)性者為甲基化陽(yáng)性；非甲基化特異引物對(duì)UF/UR擴(kuò)增陽(yáng)性且MF/MR擴(kuò)增陰性者為甲基化陰性。以未經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA作為野生型引物的擴(kuò)增模板，經(jīng)Sss I甲基化酶處理成完全甲基化的DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，以設(shè)有甲基化陽(yáng)性對(duì)照的實(shí)驗(yàn)判為C-erbB2基因CpG島啟動(dòng)子未甲基化的DNA作為陰性對(duì)照。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用兩樣本率比較的χ2檢驗(yàn)和四格表精確檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1癌組織和癌旁組織MSP結(jié)果 在所測(cè)40份腸道腫瘤標(biāo)本中，21份癌組織檢測(cè)到C-erbB2基因啟動(dòng)子CpG島甲基化（52.5%）（其中11份癌組織中同時(shí)檢測(cè)到甲基化和未甲基化條帶），30份癌旁組織中檢測(cè)到甲基化（75.0%）。40份腸道腫瘤癌組織和癌旁組織C-erbB2基因甲基化陽(yáng)性率分別為52.5%（21/40）和75.0%（30/40），兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.38，P<0.05）。

2.2腸道腫瘤中C-erbB2基因甲基化與臨床和病理特征的關(guān)系 見表1。

C-erbB2基因甲基化率在T2～T3、T4 期腸癌中分別為52.6%（20/38）、50.0%（1/2），兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)性意義（P>0.05）；與性別、年齡及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)（P>0.05）。

3 討論

3.1 C-erbB基因位于第17號(hào)染色體長(zhǎng)臂（17q21），C-erbB2原癌基因正常情況不但不引起腫瘤，還具有重要生理功能，在細(xì)胞進(jìn)行生命活動(dòng)中必不可少[5]。研究表明，在多種細(xì)胞系和實(shí)體腫瘤中存在C-erbB2基因的擴(kuò)增、過(guò)度表達(dá)、點(diǎn)突變或甲基化等改變，提示C-erbB2基因過(guò)度表達(dá)可能與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

3.2 CpG島通常出現(xiàn)在基因的5'端，是發(fā)生甲基化的區(qū)域[6]。正常細(xì)胞CpG島多處于非甲基化狀態(tài)，但細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí)某些抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島發(fā)生甲基化[7]。

3.3腸癌是我國(guó)消化系統(tǒng)最常見惡性腫瘤，本研究數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，C-erbB2在腸癌組織中有一定程度過(guò)甲基化，但與腸癌患者的性別、年齡、臨床分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)關(guān)，提示C-erbB2的低甲基化可能是C-erbB2蛋白高表達(dá)的原因之一。

3.4與腫瘤中遺傳性改變不同，DNA甲基化改變是可逆的，因此通過(guò)去甲基化處理可以起到預(yù)防和治療腫瘤的作用[7]。去甲基化藥物在一些難治性腫瘤，特別是在白血病治療方面已取得較好療效[8]。

3.5 MSP法只需極少量DNA用于分析，具有靈敏、特異的優(yōu)點(diǎn)。利用甲基化和非甲基化DNA單鏈序列的差異來(lái)設(shè)計(jì)不同的PCR引物，這類引物放大甲基化的DNA單鏈（MSP）或非甲基化的DNA單鏈。若引物選擇和設(shè)計(jì)不當(dāng)或者亞硫酸氫鈉對(duì)DNA處理不完全，易導(dǎo)致假陽(yáng)性，本研究通過(guò)專用軟件設(shè)計(jì)引物，并設(shè)置野生型引物監(jiān)測(cè)亞硫酸氫鈉處理DNA的效果，較好解決了這一問(wèn)題。

3.6熱啟動(dòng)PCR和降落PCR的應(yīng)用 低溫下Taq酶仍有活性，熱啟動(dòng)PCR可以降低非特異性產(chǎn)物。DNA復(fù)性時(shí)，溫度過(guò)高，不利于引物與模板結(jié)合和引物延伸；溫度過(guò)低，則會(huì)導(dǎo)致堿基對(duì)錯(cuò)配，導(dǎo)致假陽(yáng)性出現(xiàn)，降落PCR在初始若干循環(huán)中選用高溫變性和退火，有利于引物與模板特異性結(jié)合，在后繼循環(huán)中，由于初始循環(huán)積累的產(chǎn)物與引物的結(jié)合有濃度優(yōu)勢(shì)，仍可得到特異性產(chǎn)物，使反應(yīng)的特異性和敏感性都得以提高。

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編輯/哈濤