青蒿琥酯對膀胱癌T—24細胞生長的影響

摘要：目的 探討青蒿琥酯（artesunate，Art）對人膀胱癌T-24細胞的抑制作用及機制。方法 用不同濃度的Art干預人膀胱癌T-24細胞，采用MTT法檢測用藥后細胞增殖的改變；劃痕實驗檢測魚藤素對細胞遷移能力的影響；流式細胞術（FCM）檢測細胞周期的改變和凋亡率。結果 與對照組比較，Art可顯著抑制人膀胱癌T-24細胞株增殖（P<0.01）；劃痕實驗結果顯示，魚藤素可降低T-24細胞的遷移能力；FCM結果顯示Art可使人膀胱癌T-24細胞周期阻滯在G0/G1期，并可誘導 T-24細胞的凋亡（P<0.01）。結論 Art可顯著抑制T-24細胞的增殖以及降低其遷移能力，其機制可能與Art使T-24細胞生長周期阻滯在G0/G1期并誘導其凋亡相關。

關鍵詞：膀胱癌；T-24細胞；青蒿琥酯；凋亡；細胞周期

膀胱癌是泌尿外科最常見的腫瘤，現仍以手術治療為主，輔以化療以及免疫治療等其他治療方法，其中化療在其中起著關鍵的作用，但療效不是很顯著，治療指數低，且副反應較大[1]，因此尋找新的、療效顯著的藥物迫在眉睫。青蒿琥酯（artesunate，Art）是我國傳統中藥自主知識產權藥品，但近期研究發現青蒿素及其衍生物對多種腫瘤細胞均有一定的抑制效應，顯示出非常好的療效[2-6]。但其對膀胱癌的抑制作用尚未見相關報道。因此，本實驗通過觀察Art對人膀胱癌T-24細胞的抑制作用，并初步探討其可能的作用機制，為Art下一步臨床應用提供相應的臨床理論依據。

1資料與方法

1.1一般資料 人膀胱癌T-24細胞由華中科技大學同濟醫學院惠贈；DMEM培養基為美國Gibco公司產品；優級胎牛血清為杭州四季青生物工程有限公司產品； MTT為美國Sigma公司產品； Art注射液為桂林南藥股份有限公司（批號030801）產品；磷脂結合蛋白（Annexin V，LBMs306BB）以及碘化丙啶（PI）為美國Caltag公司產品。流式細胞儀為美國Beckman coulter公司產品；酶標儀為美國Bio-Rad公司產品。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 人膀胱癌T-24細胞培養于10%胎牛血清的DMEM培養基（含100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素）中，于37℃，5% CO2的細胞培養箱中培養，用0.25%的胰酶進行消化傳代，取對數生長期的細胞進行相關實驗。

1.2.2細胞增殖抑制試驗（MTT法） 將人膀胱癌T-24細胞以每孔5×103個細胞數接種于96孔培養板中，每孔培養液200 μL。分組為：對照組、藥物組（使Art終濃度為10、40、60 μmol/L）；待細胞貼壁生長后，藥物組細胞分別加入相應濃度的Art，對照組中加入等體積培養液，每組均設3個復孔，置于370C，5% CO2條件下培養箱中分別孵育24、48、72 h后，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL） 20 μl，再次置于細胞培養箱中繼續培養4 h后終止培養，棄掉培養液，每孔加入150 μl DMSO，充分振蕩10 min，使結晶充分溶解。選擇490 nm波長，在酶標儀上測定各孔光密度值OD490，實驗重復3次。按下列公式計算細胞抑制率：細胞抑制率（%）=（對照組D490值-用藥組D490值）/對照組D490值×100%。

1.2.3劃痕實驗檢測Art對T-24遷移能力的影響 將T-24細胞接種于6孔細胞培養板中，使細胞密度為2×105個細胞/孔，分組為：對照組、Art組（40、60 μmol/L），將細胞進行培養24 h后，用10 μL槍頭于細胞層中劃一直線，形成寬度均勻一致的細胞傷口模型，每孔劃3條傷痕，用PBS洗掉懸浮的細胞后，再加入相應濃度藥物，而對照組中加入等體積培養液，分別在培育0、24、48 h時，于光學顯微鏡（×100）下觀察并測量劃痕的寬度，分別計算3條平行劃痕的平均距離（每條劃痕各取3個固定位置計算距離），實驗重復3次。細胞遷移能力以遷移率表示： 遷移率=（原劃痕寬度-現劃痕寬度）/原劃痕寬度。

1.2.4流式細胞儀（FCM）測定Art對T-24細胞周期以及凋亡的影響 取處于數生長期的人膀胱癌T-24細胞，消化傳代后，重新接種于培養瓶，使其密度為5×105/ml；分組為：對照組、藥物組（使Art終濃度為10、40、60 μmol/L）；待細胞貼壁后，藥物組細胞分別加入相應濃度的Art，對照組加入等體積培養液，培養48 h后收集細胞，用70%冷乙醇分散固定細胞，4℃過夜。取固定好的細胞加PBS洗滌一次，離心棄上清，然后加入50 μg/ml的RNase 1 ml置于37℃水浴鍋中30 min，離心去上清，加入60 μg/ml的PI 1 ml，避光孵育30 min，經尼龍網過濾，上機進行檢測，用流式細胞儀進行細胞周期以及凋亡分析。

1.3統計學分析 應用統計學軟件SPSS 13.0進行統計學分析，數據用x±s 表示，同一濃度各處理組間采用單因素方差分析進行比較，組間兩兩比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 Art對膀胱癌T-24細胞增殖的影響 MTT實驗結果顯示：藥物組各個濃度均可顯著抑制膀胱癌T-24細胞的增殖，而且Art對膀胱癌T-24細胞的抑制作用隨著濃度的增加及作用時間的延長而遞增，呈現明顯的時效、量效關系，各實驗組與對照組比較，差異具有統計學意義（P<0.01），見表1。

2.2 Art抑制膀胱癌T-24細胞的遷移 細胞劃痕實驗結果顯示，40 μmol/L、60 μmol/L的 Art作用T-24細胞24 h、48 h后的劃痕寬度均大于對照組，計算各組細胞的遷移率發現，Art作用細胞24 h、48 h后，其遷移率均與對照組相比較，差異有統計學意義（P<0.01），見表2，表明不同濃度的Art可降低T-24細胞的遷移能力。

2.3 Art對膀胱癌T-24細胞周期以及凋亡的影響 流式細胞術結果顯示，對照組中T-24細胞處于S期的比例最高，表明腫瘤細胞生長旺盛，而各濃度藥物組均可使S期、G2/M比例降低，使G0/G1比例增加，與對照組比較，差異具有統計學意義（P<0.05），見表3，表明Art通過阻滯T-24細胞進入S期而發揮其抑制腫瘤細胞生長的作用。另外，不同濃度Art作用T-24后，T-24細胞凋亡率隨著劑量的增加而增大，與對照組比較，差異具有統計學意義（P<0.01），見表3，表明Art可引起膀胱癌T-24細胞的凋亡。

3討論

2010年美國癌癥學會最新統計調查發現，膀胱癌的發病率在男性占全身腫瘤的第四位。死亡率占全身腫瘤的第九位[7]。目前針對膀胱癌的治療主要是手術聯合化療，但療效都不顯著，且化療副作用較多，限制了許多藥物的應用，故尋找新的、療效顯著及副作用少的藥物是非常有必要的。

而植物制劑治療腫瘤具有副作用小，療效可靠等優點，顯示出非常好的前景。因此，從中草藥等植物藥中篩選提取治療膀胱癌的新藥是目前研究的重點與熱點之一[8]。青蒿素是由我國科學家研究發現并從黃花蒿中提取的抗瘧疾新藥。近期有研究發現[9]Art有明顯的抑制鼠H22肝癌細胞的作用，另外有研究發現[10] Art可顯著抑制正常人臍靜脈內皮細胞以及腎移植后的Kaposi's肉瘤KS-IMM細胞。由此可見，Art具有很好的抗腫瘤作用。

我們通過MTT法檢測發現Art各濃度組可顯著抑制T-24細胞的增殖，且Art對T-24細胞的抑制效應隨著藥物濃度增加及作用時間延長而具有遞增趨勢，具有明顯的時效、量效關系；細胞劃痕試驗結果顯示Art可抑制其遷移；FCM分析結果顯示不同濃度Art可使S期細胞明顯減少，G0/G1期比例增加，G2/M期無明顯變化，表明 Art通過阻滯T-24細胞進入S期而發揮抑制生長的作用，且Art能夠促進T-24細胞的凋亡。這與其他學者研究發現[11-12]Art可將 P388細胞、L1210細胞阻滯于G1期以及誘導其凋亡的結果相一致。

綜上所述，Art可顯著抑制膀胱癌T-24細胞的增殖，降低其遷移，其機制可能與阻止細胞周期以及誘導細胞凋亡相關，但具體作用機制還有待更進一步研究，本實驗為Art用于膀胱癌的治療提供了一定的理論依據。

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